Bernadette Pinel-Alloul 19 décembre 2005 Toxicologie de l’environnement TXL 6014 Notions de bioindicateurs et biomarqueurs en écotoxicologie Bernadette Pinel-Alloul 19 décembre 2005

Suivi des effets des contaminants sur l’environnement Expériences: 1950-1980 exposition à des [...] élevées court terme (24-92h) état d’équilibre non-atteint Observations: 1980-2000 exposition chronique in situ long terme (400 j – 10 ans) état d’équilibre atteint Tests de toxicité en laboratoire Expériences in situ Suivi sur le terrain Réalisme environnemental  Conditions contrôlées Manque de réalisme Pas de facteurs confondants Conditions peu contrôlées Meilleur réalisme Plus de facteurs confondants Contrôle expérimental 

Bioindicateurs-biomoniteurs ÉCOLOGIE: Organismes caractéristiques d’un type d’habitat ou de conditions environnementales (bioindicateurs: présence-absence). Conditions: acidification, eutrophisation, eaux courantes, lacs. Très utiles en reconstruction paléolimnologique de l’évolution des lacs et pour la surveillance écologique de l’état des lacs. ÉCOTOXICOLOGIE: Organismes sentinelles reflétant les niveaux de pollution ambiants (biomoniteurs) et permettant de surveiller et mesurer la bioaccumulation des polluants dans les communautés vivantes. Très utiles pour le biomonitoring de la contamination et des effets des polluants dans les milieux récepteurs.

Pertinence écotoxicologique  Signal recherché Exposition Dose interne Biomoniteur Dose biologiquement active Biomarqueur d’exposition Biomarqueur d’effet Effet biologique précoce Structure/fonction altérées État de santé 

Bioindicateurs et biomarqueurs Algues Diatomées, Chrysophycées Moules, Insectes Moules d’eau douce: Pyganodon, Elliptio, Larves d’insectes : Hexagenia, Chaoborus Crustacés, Vers Amphipodes: Hyalella azteca Oligochètes: Limnodrilus sp. Poissons Perchaude, Brochet Biomarqueurs biochimiques charge énergétique: ATP, ADP, AMP Enzymes (glutation, malondialdehyde) Métallothionéine Biomarqueurs physiologiques Taux de respiration Facteur de condition Hepatosomatic index Difformités morphologiques Diptères Chironomides Tumeurs labiales Poissons benthiques

Critères d’un bioindicateur Espèce tolérante à la pollution qui peut bioaccumuler les contaminants indicateur d’exposition et d’effet sous-létal (mollusques > crustacés > poissons) Espèce très sensible à la pollution indicateur précoce d’alarme (insectes aquatiques, truites) Espèce cosmopolite et commune Espèce abondante et facile à récolter et reconnaître Espèce sessile, de grande taille, à biologie connue Espèce facile à transplanter et à utiliser en laboratoire Espèce clé au sein des réseaux trophiques Population représentative Grande longévité

Critères d’un bioindicateur Les relations entre la concentration de contaminant bioaccumulé et la concentration de contaminant dans le milieu (ou nourriture) doivent être identiques pour tous les individus de même taille ou de même âge de l’espèce bioindicatrice. Source: Rask et al. (1994)

Critères d’un bioindicateur Variabilité saisonnière bien établie : choix des périodes stables Source: Hare, 1992, Crit. Rev. Toxicol. 22: 327-369.

Mollusque pélécypodes Unionidés Elliptio complanata Saint Laurent: métaux Pyganodon grandis grandis Lacs miniers: métaux Lampsilis radiata

Types de bioindicateurs Source: Beeby. 2000. Environ. Pollut. 112: 285-298

Organismes sentinelles Lichens (smog réducteur: SO2) Moules et bivalves Mytilus edulis (métaux) Unionidés (métaux) Vers marins Capitella (métaux, organiques) Ratio Nématodes/Copépodes Poissons coralliens Algues Invertébrés benthiques Gastéropodes Bivalves Crustacés Vers Oligochètes Tubificidés Insectes aquatiques Diptères Chironomides Trichoptères, Plécoptères

Emploi relatif des bioindicateurs Bactéries coliformes: eaux usées Pollution acide Pollution organique Pollution par les métaux

Système des Saprobies Pollution organique - Europe Peu pollué Très pollué *Très bonne connaissance taxonomique

Milieux polysaprobes Protozoaires Vers Amibe nue Ciliés Vorticella Nématodes Oligochètes Ciliés Diptères Chironomides Cyanobactéries toxiques Vorticella

Milieux  mesosaprobes Protozoaires Paramécies Isopodes Gastéropodes Planaires Ciliés Megaloptères Sangsues Algues vertes Diptères Simulidés Pisidium

Milieux  mesosaprobes Protozoaires Ephémères Amphipodes Gastéropodes Carchesium Trichoptères Algues diatomées

Milieux oligosaprobes Plécoptères Ephémères Trichoptères Odonates

Indices et métriques

Mesures de la diversité biologique Indices de diversité spécifique: Indice de Shannon-Weaver S H’ = - (ni/N )•log2(ni/N) i=1 Indices d’intégrité biotique basés sur l’abondance relative d’espèces tolérantes et intolérantes Distributions rang-fréquence Structure trophique Source: Ramade, 1992.

Études de cas Pollution par le mercure et les BPCs dans le lac Saint-François (Saint-Laurent) Pollution par le cadmium (Cd) et le mercure (Hg) dans le fleuve Saint-Laurent Pollution par le cadmium dans la région minière de l ’Abitibi

Lac Saint-François -Hg

Lac Saint-François -BPC

Invertebrate Community Index (ICI)

Métrique ICI

Substrat Hg BPC BPC

ICI- Pollution Effets confondants des facteurs écologiques Herbiers Sédiments M.O. Facteurs écologiques Granulométrie Contamination Hg, BPC

J. Désy1, C. Flessas1, J-F. Archambault1 B. Pinel-Alloul1, J. Hubert1 Bioaccumulation du cadmium et du mercure dans les invertébrés benthiques du fleuve Saint- Laurent: Utilisation des espèces sentinelles: les gastéropodes Bithynia tentaculata et Physa gyrina J. Désy1, C. Flessas1, J-F. Archambault1 B. Pinel-Alloul1, J. Hubert1 et P.G.C. Campbell2 1Université de Montréal 2INRS-ETE 1990-1992

Objectifs Déterminer les relations entre les concentrations de Cd et de Hg dans les organismes sentinelles avec les concentrations de Cd et Hg dans les sédiments ou les concentrations de l ’ion libre Cd2+ dans l ’eau interstitielle. (2)Déterminer si les espèces sentinelles sont de bons biomoniteurs des niveaux de contamination du fleuve en Cd et en Hg.

Sites d ’étude: Fleuve Saint-Laurent 20 stations : - LSF: Lac St.François - LSL: Lac St.Louis - BLP: Bassin Laprairie - CTC: Région de Contrecoeur - LSP: Lac Saint-Pierre Stations: profondeurs: 0.5 à 3.5 m zones de sédimentation zone littorale plantes submergées

Cadmium - gastéropodes Milieu Espèces bioindicatrices Bithynia tentaculata Algues Métal non-essentiel Milieu Physa gyrina

Zn - gastéropodes Milieu Métal essentiel Bithynia t. Physa g. Plantes

Méthyl-mercure - Gastéropodes Fleuve Saint-Laurent Bithynia tentaculata Lac Saint Louis

Définition des biomarqueurs Toute réaction biochimique, physiologique, histologique et morphologique en réponse à un contaminant, mesurée à l ’intérieur d ’un organisme, et qui indique une déviation de son état normal (van Gestel et van Brummelen, 1996, Ecotoxicology 5: 217:225) Approche hiérarchique d’évaluation de la toxicité du niveau cellulaire à l’individu, à la population et à la communauté Hypothèse du débordement cellulaire

Niveau cellulaire/sub-cellulaire Niveau physiologique Perturbations des voies biochimiques Individus ne pouvant survivre ou se reproduire Espèce absente Organisme Population Communauté Détoxication granules métallothionéines Compensation changements comportementaux adaptations physiologiques survie individuelle changements dans l’allocation d’énergie immigration tolérance génétiquement acquise Interaction initiale du métal à ce niveau Débordement Stress physiologique individus faibles reproduction inhibée vulnérabilité au stress

Propriétés des biomarqueurs Indicateurs précoces: doivent prédire des effets toxiques à des niveaux élevés de l ’organisation biologique. Spécifiques d’un contaminant ou d’une classe de contaminants. Réponses concentration-dépendante. Les facteurs endogènes (sexe, taille, état reproducteur) et exogènes (Ca++, H+, COD) pouvant affecter la réponse du biomarqueur doivent être connus. Le biomarqueur doit être relié à l ’état de santé ou au « fitness » de l’organisme. Les études expérimentales doivent passer par une validation sur le terrain.

Types de biomarqueurs Enzymes: ALAD (Acide AminoLévulinique Déhydratase): inductible par le plomb. Cytochromes P450: classes d’hémato-protéines inductibles par les contaminants organiques. Cholinestérases: activité inhibée par les carbamates et les pesticides organophosphorés. Enzymes de conjugaison: accroissement causé par les HAP, ou les métaux traces. Ex: gluthathion-S-transférase. Enzymes de stress oxydatif. Ex: glutathion reductase, malondialdehyde Métallothionéines (MTs): augmentation causée par les métaux traces. Protéines de stress (glucose-regulated proteins, heat stress proteins): spécificité relativement faible. ADN: modifications de la structure d ’ADN (formation d ’adduits). Sources multiples.

Évaluation de la métallothionéine (MT) comme biomarqueur d’exposition métallique et d’effets toxiques en milieu naturel B. Pinel-Alloul1, O. Perceval1, Y. Couillard2, A. Giguère3, P.G.C. Campbell3 et L. Hare3 1Université de Montréal 2Environnement Canada 3INRS-ETE 1989- 2005

Évaluation des effets de l ’exploitation minière sur le milieu aquatique au Canada S’acquitter de l’engagement pris par Environnement Canada de mettre à jour et renforcer le Règlement sur les effluents liquides des mines de métaux (RELMN) Conception, pour les mines de métaux, d’un programme de suivi des effets sur l ’environnement développement d ’outils efficaces pour la réalisation d’un tel suivi.

Les métallothionéines (MTs) Domaine  Métal Soufre Domaine 

Rôle de la métallothionéine Régulation des concentrations intracellulaires des métaux essentiels (Zn, Cu) chez les animaux (Kelly et al., 1996). Protection contre la toxicité des métaux non-essentiels (Cd) (Roesijadi, 1992). Protection contre le stress oxydatif à la fois à l’échelle de la cellule et de l’organisme (Viarengo et al., 1999).

Objectifs de l ’étude MT = biomarqueur d’exposition au Cd MT = biomarqueur d’effets toxiques: Corréler l’augmentation du Cd lié à des ligands cytosoliques autres que la MT à des effets biologiques délétères au niveau de la cellule au niveau des populations

Modèle de cytotoxicité Faible contamination Forte contamination Cd-MT 1 Cd-FPM 2 noyau cytosol A. Cd-HPM Cd2+ B. Modèle du débordement cellulaire des ligands

Organisme sentinelle : bivalves Sédentaire Vit jusqu’à 15 ans Tolérant aux métaux Capacité à accumuler les métaux Capacité à synthétiser la MT Suivi à long terme Pyganodon grandis grandis

Réponses concentration dépendantes Tessier et al., 1993, L&O 38: 1-17 Couillard et al., 1993, L&O 38: 299-313

Aire d ’étude R. Kinojévis ROUYN-NORANDA Destor Dasserat Ollier Waza D ’Alembert Beauchastel Adéline Évain Hélène Renaud Bouzan Héva Caron Cléricy Opasatica Vaudray Petit Dufresnoy Dufay Bousquet Joannès ROUYN-NORANDA R. Kinojévis

Approche écotoxicologique intégrée Variables physico-chimiques et écologiques confondantes  [Chl a], [C(seston)], [N(seston)], pH, [Ca]d, conductivité, [COD], [AH+AF], chaleur accumulée en degré-jours  Abondance des poissons hôte Réponses des populations  Abondance (densité littorale)  Biomasse et structure en taille  Production annuelle  Rapports P/B  Fécondité (individuelle et cumulée) Contamination des moules Réponses intracellulaires  [Cd] dans le cytosol  [MT] dans les branchies  Répartition intracellulaire du Cd: Cd-MT/ Cd-FPM/ Cd-HPM Indicateurs enzymatiques de stress toxique: MDA/ Glutathion Contamination des lacs Niveau d’exposition Sédiments superficiels - eau surnageante  [Cd2+]

Caractéristiques des lacs sélectionnés: gradient de contamination en Cd Rapport Max/Min = 270 contamination niveau moyen contamination niveau élevé contrôle

Métallothionéine dans les branchies r2= 0,50; P < 0,001 r2= 0,78; P < 0,001 Dans des conditions d’exposition chronique: MT = biomarqueur d’exposition au Cd

Modèle de cytotoxicité B. Cd-MT Cd-FPM 2 noyau cytosol Cd2+ Cd-HPM Modèle du ligand biotique Saturation de la MT Incorporation dans HPM Incorporation dans FPM

Répartition intracellulaire du Cd Dans des conditions d’exposition chronique: Liaison progressive du Cd à des ligands autres que la MT Cytotoxicité observée suite à cette exposition r2= 0,95 P < 0,001 r2= 0,37 P < 0,001 r2= 0,68 P < 0,001

Superoxide theory on oxygen toxicity Reactive oxygen species O2-, ·OH & H2O2 Oxygen Endogenous reaction Cellular lipid membrane Degradation Increase in Malondialdehyde (MDA) Antioxidants (GSH; GSH-peroxidase; GSH-reductase) Organic contaminants Cu2+, Fe2+ (Cd2+?) (Fridovich, 1975)

Évidence de stress oxydant au niveau cellulaire contamination niveau très élevé Source: Giguère et al., 2003, Aquat. Toxicol., 64:185-200.

Effets au niveau des populations: densité littorale

Effets au niveau des populations: biomasse et production * Punilat. < 0,05; ** Punilat. < 0,0083

Effets au niveau des populations: taux de renouvellement : ratio P/B

Structures d’âge P/B=0,27 P/B=0,28 P/B=0,33 P/B=0,31 P/B=0,21 P/B=0,23 0,22 0,20

Effets au niveau des populations: fécondité cumulée

Influence des variables confondantes

Expériences de transplantation: 400 jours Lac de référence Opasatica : Cd2+: 0.03 nM, Ca: 9.2 mg/L Lacs de niveau de contamination moyen Joannès: Cd2+: 0.25 nM, Ca: 7.7 mg/L Vaudray: Cd2+: 0.39 nM, Ca: 3.5 mg/L Lacs de niveau de contamination élevé Dasserat: Cd2+: 1.08 nM, Ca: 9.3 mg/L Dufault: Cd2+: 0.76 nM, Ca: 19.3 mg/L

Expériences de transplantation: 400 j niveau de contamination des bivalves Très faible Ca Comparaison des niveaux de contaminants des bivalves dans les enceintes et hors des enceintes

Expériences de transplantation: 400 j répartition subcellulaire du Cd Ligands les plus importants: MT et HPM Lac Vaudray: Cd-MT très fort: bonne détoxication Lac Dufault : Cd-HMW très fort: maximum de toxicité

Expériences de transplantation: 400 j réponse des populations Croissance Mortalité Effet protecteur de la MT

Suivi à long terme: 1989-2002 Baisse des émissions de la fonderie de Noranda

Baisse des concentrations du biomarqueur d’exposition (MT) chez les bivalves Relation avec les baisses de Cd et Cu En amont de la fonderie OP: Opasatica 29 km Du: Dufay 39 km En aval de la fonderie JO: Johannes 26 km VA: Vaudray 30 km BO: Bousquet 30 km HE: Héva 51 km

Cohérence temporelle entre les baisses des émissions, du niveau de pollution, de la bioaccumulation des métaux et du biomarqueur MT

Conclusions de l ’étude La MT peut être utilisée comme biomarqueur d’exposition et de contamination chez les invertébrés d’eau douce Potentiel d’utilisation de la répartition sub-cellulaire du Cd (Cd-MT, Cd-HPM, Cd-FPM) comme biomarqueur prédictif du risque toxicologique au niveau cellulaire Potentiel mais manque de certitude pour assigner à la répartition sub-cellulaire du Cd un rôle prédictif d’effets écotoxicologiques sur l’état des populations de bivalves Influence des facteurs confondants au niveau écologique: Chaleur accumulée dans la zone littorale des lacs reliée à la morphométrie des lacs, niveau de dureté des eaux reliée aux concentrations en calcium.

Conclusions (suite) Hypothèse: En raison des efforts de traitement de l’industrie minière dans la région, les facteurs écologiques ont supplanté la pression de contamination exercée par le Cd comme élément structurant des populations de bivalves Le manque de connaissance sur les effets confondants des facteurs écologiques en milieu naturel limite de beaucoup la signification écotoxicologique de la MT et de la répartition subcellulaire du Cd dans les ligands cytosoliques comme biomarqueur d’effets toxiques au niveau des populations Les études au niveau des communautés restent à faire