Les enzymes de restriction Biologie Moléculaire Les enzymes de restriction

Enzymes de Restriction Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes

5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Palindromes La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brins 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’

5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ Palindromes La base à une position determine la base coresspondante à la même position sur l’autre brin 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’

Palindromes CAC_ _ _ GT _ TA _ AT _ _ AT _ _ CACGTC GTATAC ATATATAT Complétez les palindromes suivants CAC_ _ _ GT _ TA _ AT _ _ AT _ _ CACGTC GTATAC ATATATAT

Palindromes Problème Combien de palindromes de 4 bases sont possibles? N1N2N3N4 Position 1: 4 choix (A, G, C, ou T) Position 2: 4 choix (A, G, C, ou T) Position 3: 1 choix (déterminer par la position 2) Position 4: 1 choix (déterminer par la position 1) Donc: 4 X 4 X 1 X 1 =16

Combien de palindromes est-ce que l’enzyme AccI reconnaît? Problème Combien de palindromes est-ce que l’enzyme AccI reconnaît? GTMKAC (M= A ou C; K = G ou T) 1 X 1 X 2 X 1 X 1 = 2

Fréquence d'occurrence Probabilité de retrouver un palindrome donnée Dépend de la distribution des bases Ex. 50% G ou C ou 1/4 pour chaque base Quelle est la probabilité d’occurrence de GGATCC? 1/46 ou 1 divisé par (0.25)-6 = 1/4096 Combien de fois est-ce que cette enzyme serait prévue de couper dans un génome de 10 kb? 1/4096 X 10000 = 2.44 Arrondir au chiffre entier le plus proche. Donc 2X

Fréquence d’occurrence Problème Quelle est la probabilité de retrouver n’importe quel palindrome de 4 base dans un génome qui est 50% G ou C Nombre de différentes séquences de 4 bases 44 = 256 Nombre de différent palindromes de 4 bases 4 X 4 X 1 X 1 = 16 Probabilité de retrouver un palindrome de 4 bases 16/256 = 1/16

Fréquence d’occurrence Distribution inégale des bases Déterminer la séquence de chaque palindrome possible Déterminer la probabilité de chaque palindrome d’après la distribution des bases Déterminer la somme des probabilités Ex. AccI coupe GTMKAC (M= A ou C; K = G ou T) Distribution des bases: 70% G/C, 30% A/T 2 palindromes possible GTATAC: (0.35)(0.15)(0.15)(0.15)(0.15)(0.35) = 1/16125 GTCGAC: (0.35)(0.15)(0.35)(0.35)(0.15)(0.35) = 1/2962 Probabilité: 1/2502

5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Clivage Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’

Différentes extrémités sont générées 3’-C C T G A A G T C C-3’ G-5’ Extrémités franches

Différentes extrémités sont générées 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Extrémités 5’ protubérantes

Différentes extrémités sont générées 3’-C 5’-G G A T C C-3’ C T A G G-5’ Extrémités 3’ protubérantes

Compatibilité des extrémités Extrémités franches HO P OH O P Compatible

Compatibilité des extrémités Extrémités Protubérantes HO P OH HO P O Incompatible

Compatibilité des extrémités Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Appariement GATC-P O P-CTAG O Compatible

Compatibilité des extrémités Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Appariement GATC-P OH P-TCCA HO Incompatible

Extrémités compatibles Quels sites de restriction de la liste 1 génèreraient des extrémités qui seraient compatibles avec ceux générées de la liste 2? Liste 1 GA▼TATC AAAT ▼ TT CGC ▼ CGC A ▼ CGCGT Liste 2 CCAT ▼ GGC CAC ▼ GTG CCGC ▼ GG CCATAT ▼ ATGG 2+A & 2+D

Cartes de Restrictions

Cartes de restrictions Déterminer les positions des sites de restrictions Cartes d’ADN linéaires Cartes d’ADN circulaires (plasmides) Cartes d’insertions dans un vecteur Cartographie des génomes Analyse Southern

Approche Déterminer si l’ADN a été digéré La digestion est elle complète ou partielle? Combien de coupures? Déterminer les positions relatives

L’ADN est-il digéré? Comparez au témoin non digéré Échelle Témoin Quelles échantillons n’ont pas été digérés? 1 et 4 Quelles échantillons ont été digérés? 2 et 3 1 2 3 4

La digestion est-elle complète? Digestion complète Toutes les molécules d’ADN sont clivées à tous les sites possibles Digestion partielle Une fraction des molécules non pas été digéré Partielle non digéré Une fraction des molécules a été digéré, mais pas à tous les sites possibles

Digestion complète Digestion

Digestion partielle: partielle non digéré

Digestion partielle partielle Digestion

La digestion est-elle complète ou partielle? Échelle Témoin 1 2 3 4 Comparez au témoin Vérifiez l’intensité des bandes Vérifiez les tailles

Déterminer les positions relatives Combien de coupures? Nombre de sites ADN circulaire = nombre de bandes ADN linéaire = nombre de bandes – 1 Déterminer les positions relatives La taille des fragments représente la distance entre les sites

Cartes d’ADN linéaires Enzyme Fragments (Kb) HindIII 3 et 4 SalI 2 et 5 HindIII + SalI 2 et 3 7.0 3.0 4.0 HindIII HindIII + SalI 2.0 3.0

Cartes d’ADN circulaires (plasmides) Enzyme Fragments (Kb) BamHI 2, 3 et 5 HindIII 1 et 9 BamHI + HindIII 1, 1.5, 2, 2.5 et 3 3.0 2.0 1.0 1.5 2.5 7.0 10.0 1.0 9.0 10.0

Plasmides recombinants SCM X Digéré avec X Vecteur

Plasmide recombinant + Insertion X Recombinant Vecteur + insert

Déterminer la carte de restriction d’un insert Étape 1: Déterminer le site d’insertion + Insertion X Couper avec X

Cartes d’insertions Taille totale Taille de l’insertion 7.7Kb Taille de l’insertion 7.7 – 2.7 = 5.0Kb Site d’insertion Génère 2 fragments dont un est la taille du vecteur XbaI Enzyme Fragments BamHI 7.7Kb EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0

Déterminer l’orientation relative Le site d’insertion delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite

Déterminer l’orientation relative X A X Orientation 2 A X A X

Cartographie relative Sites a cartographier Enzyme Fragments Coupures totales Coupures vecteur Coupures insertion BamHI 7.7Kb 1 EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb 3 2 PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0 Site d’insertion

Cartographie de PstI : 2 et 5.7Kb 5.0

Cartographie de EcoRI: 1, 3 et 3.7Kb 1.0 3.0 1.0 1.0 3.0

Analyse de restriction d’ADN complexe Buts Trouver la position d’une séquence dans des gros fragments d’ADN Trouver des séquences similaires dans d’autres organismes Analyse d’ADN non-séquencé

Digestion d’ADN complèxe Le nombre de fragments rend l’analyse impossible

Analyse Southern Séparer les fragments d’ADN d’après leurs tailles Dénaturer Hybridation avec une sonde simple brin qui représente la région d’intérêt La sonde permet de visualiser seulement la région d’intérêt

Southern Sonde Gel d’agarose Hybridation à la sonde

Problème Des fragments de quelles tailles serait observés avec les sondes 1 et 2 après des digestions simples avec chacune des enzymes

Solution Enzyme Sonde 1 Sonde 2 C 2.5 & 11kb 11kb K >11kb X >9.8 & 10.2kb >9.8kb