Quantifier les Microorganismes

Méthodes Mesure de turbidité Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs

Nombre le Plus probable: NPP Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon

Nombre le Plus Probable (NPP) Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes -1 -2 -3 -4 -5 -6 Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque dilution dans chaque tube Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

NPP- Suite L’objectif est de DILUÉ l’organisme à zero Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre les caractéristiques désirées sont enregistré Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre Dilutions: -1 -2 -3 -4 Tubes positifs: 3 2 1 0 P : Nombre de tubes positifs N : Quantité totale en (g) ou (ml) d’échantillon dans tous les tubes négatifs T : Quantité totale en (g) ou (ml) d’échantillon dans tous les tubes

NPP Calcul Dilutions: -1 -2 -3 -4 Tubes positifs: 3 2 1 0 P =6 N = (3 X (0,1 X 10-4)) + (2 X (0,1 X 10-3)) + (1 X (0,1X10-2)) = 1.23X10-3 T= (3 X (0,1 X 10-1) + (3 X (0,1 X 10-2) + … (3 X (0,1 X 10-4) = 3.33X10-2 = 6/0,000041 =1.46X105 bacteria/g

Comptes Directes L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

Déterminer le Compte Direct Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants 8, 8 et 5 Déterminer la moyenne (8 + 8 + 5)/3 =7 Donc 7 cellules/carré

Déterminer le Compte Direct (suite) 1mm Profondeur: 0.1mm 1mm Calculer le volume d’un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

Problème Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la chambre de comptage possède 100 carrés?

Colorations Différentielles Microscopie Colorations Différentielles

Coloration de Gram Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives

Gram Positives Colorées Mauves (bleu) Bacille Coccus Genres: Bacillus et Clostridium Coccus Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

Gram Négatives Colorées Rouges Bacille: Coccus: Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. Coccus: Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter

Règles Si le nom est bacillus et/ou clostridium = Gram (+), bacille Si le nom finisse par coccus ou cocci (autre que les 3 exceptions, qui eux sont Gram (-)) = forme de coccus et Gram (+) Si ça fait pas partie des règles ci-dessus, = Gram (-)

Paroi Cellulaire Gram + Vs Gram - Paroi Peptidoglycane Membrane Couche de Lipopolysaccharide Absente Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique

Méthode - Coloration Primaire + Coloration avec le cristal violet Ajout d’iode de Gram (Mordant) + + Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif

Méthode - Étape Différentielle Lavage à alcool Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique + + Gram positif Gram Négatif

Méthode - Contre Coloration + Coloration avec la Safranine + + Paroi :peptidoglycane LPS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Membrane plasmique + Gram positif Gram Négatif

Sommaire Fixation Coloration primaire Violet de cristal Lavage Décoloration Contre coloration Safranine

Coloration Acido-Alcoolo-Résistante Coloration diagnostique de Mycobactérium Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre Paroi cellulaire avec acide mycoïque Cireuse, très imperméable, solide lorsque refroidi

Méthode Principe: Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur Coloration avec de la fuchsine basique Contient du Phénol, solubiliser la couche mycoique Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de l’alcool acide Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant

Coloration de Spores Spores: Cellule bactérienne différentiée Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques Alors, très résistante aux colorant aussi! Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à l’endospore E.g. Anthrax

Coloration au Vert de Malachite Spores (structures résistantes utilisées pour la survie dans des conditions défavorables) Sporangium (strucutre dans laquelle les spores se forment) Endospore (dormant, non reproductrices) Cellules végétatives (en croissance active) Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine

Les Pathogènes

19e Siècle- Robert Koch Étudie la maladie de l’anthrax qui tue les vaches Fait croître la bactérie à partir du sang d’animaux malades en culture pure Bacillus anthracis Observations: Le sang d’animaux malades transmet la maladie Le microorganisme se retrouve seulement chez les animaux malades Le microorganisme crû en laboratoire transmet la maladie aux animaux sains

Robert Koch (suite) Conclusion: Les microorganismes sont responsables des maladies Les pathogènes Ces résultats mènent Robert Koch à élaborer des lignes directrices pour l’association d’un microorganisme à une maladie Les postulats de Koch

Postulats de Koch  Le microorganisme doit être présent dans chaque cas de maladie, mais absent des organismes sains Le microorganisme suspect doit être isolé et cultivé en culture pure La maladie doit se développer quand le microorganisme isolé est inoculé dans un hôte sain Le même microorganisme doit être isolé à nouveau de l’hôte malade