2) Purification des protéines II) Utilisation de l’ADN recombinant Les protéines recombinantes sont exprimées en grandes quantités, mais sont mélangées avec les protéines bactériennes. Il est donc nécessaire de purifier la protéine d’intérêt. 2) Purification des protéines 1

2) Purification des protéines a) Chromatographie Une technique de séparation des protéines est la chromatographie. Elle nécessite une phase stationnaire et une phase mobile, la séparation se fait en fonction de l’affinité des protéines pour chacune des phases. Exemple d’une chromatographie sur colonne : 1) Solutés (mélange) 2) Passage continu d’une phase mobile (solvant) 3) Séparation des composants de l’échantillon suivant leur affinité pour la phase mobile et la phase stationnaire Phase stationnaire

2) Purification des protéines a) Chromatographie + - Flux de solvant Molécules chargées négativement retenues sur les billes chargées positivement - Chromatographie de partage (en phase inverse) : phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire. Séparation selon le degré de polarité des composés. - Chromatographie d’échange d’ions : phase stationnaire chargée positivement ou négativement. Séparation suivant la charge des composés. - Chromatographie d’exclusion : support poreux. Séparation en fonction de la taille : les grosses molécules sortent très vite de la colonne tandis que les plus petites, qui peuvent traverser les pores sont retardées et sortent plus tard. - Chromatographie d’affinité : séparation selon des propriétés de forme. C’est la technique la plus puissante car elle repose sur des interactions spécifiques. Flux de solvant Petites molécules retardées par la traversée des billes poreuses ; grosses molécules non retardées

2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité - Immunopurification : utilisation de l’interaction Anticorps/Ligand Cette technique est spécifique de la protéine étudiée. Des anticorps reconnaissant la protéine sont fixés à des billes (phase stationnaire). Dépôt de l’extrait cellulaire sur la colonne (phase d’accrochage sur les anticorps) Protéine d’intérêt Après lavages (élimination des molécules interagissant de façon peu spécifique), les protéines d’intérêt peuvent être éluées (par exemple avec un peptide compétiteur). anticorps billes

2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité L’immunopurification permet de purifier une protéine spécifique, mais il faut disposer d’un anticorps suffisamment efficace et spécifique. De plus, on n’a pas toujours de systèmes d’élution efficaces. Etiquette (molécule de fusion, par exemple peptide de fusion) Protéine d'intérêt Protéine d'intérêt fusionnée à une étiquette On utilise aussi d’autres systèmes de chromatographie d’affinité reposant sur des interactions ligand/récepteur du ligand et l’utilisation d’une protéine recombinante fusionnée à une étiquette.

2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité Des groupements (récepteurs du ligand) fixés sur la colonne interagissent avec le peptide de fusion. Toutes les autres protéines, non retenues sur la colonne sont éliminées. Dépôt de l'extrait cellulaire sur la colonne Rétention de la protéine d'intérêt Protéine d'intérêt Peptide de fusion Protéine d'intérêt avec une étiquette Protéines bactériennes Protéines non retenues sur la colonne Lavages pour éliminer les éventuels contaminants

2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité Ajout d'un agent permettant l'élution (un compétiteur) Après élution on obtient les protéines d'intérêt fusionnées. Un clivage peut être effectué entre la protéine d'intérêt et le peptide de fusion. Un nouveau passage sur colonne d'affinité permet de retenir les peptides de fusion et de récupérer les protéines purifiées Clivage spécifique Rétention de la protéine de fusion sur la colonne Protéine d'intérêt purifiée Protéines d'intérêt éluées

Conclusion : Utilisation des protéines recombinantes : Avec de grandes quantités de protéine purifiée, possibilité d’analyser la structure 3D par diffraction des rayons X ; possibilité d’analyser les modifications post-traductionnelles de la protéine au spectromètre de masse Possibilité de co-purifier des protéines associées à la protéine étudiée si les lavages ne sont pas trop stringents Billes Anticorps Protéine d’intérêt Protéines associées Séparation des protéines sur gel ; études par Western blot pour des protéines connues ou par spectromètre de masse pour des molécules inconnues La protéine est digérée pour obtenir un ensemble de peptides. Dans le spectromètre de masse, les peptides sont fragmentés, et la masse des fragments obtenus est mesurée. L’ensemble des masses des différents fragments est caractéristique d’une molécule donnée. Cette technique permet d’identifier des molécules, mais aussi de détecter des modifications sur une protéine connue

II) Utilisation de l’ADN recombinant Différents types cellulaires sont caractérisés par l’expression de protéines différentes. L’expression différente des gènes (codant notamment pour des protéines homéotiques) dans un embryon joue un rôle clé dans la mise en place du plan d’organisation de l’organisme. Suivant les conditions, les besoins en différentes protéines changent (exemple du stress). Comment étudier l’expression des gènes, à la fois d’un point de vue quantitatif et qualitatif, et d’un point de vue spatial et temporel ? 3) Etude de l’expression des gènes 9

3) Etude de l’expression des gènes a) Quantification des protéines dans un extrait cellulaire Par Western blot : pas de quantification absolue. On peut obtenir des données comparatives qualitatives entre différentes conditions. Un gène de ménage est souvent utilisé comme référence. Par dosage : méthodes spectroscopiques, immunologiques, enzymatiques Indirectement par Northern blot : information sur la quantité d’ARN messager correspondant à la protéine (Rq : une augmentation des ARNm peut provenir d'une augmentation de la transcription ou d'une augmentation de la stabilité des ARNm). Le Northern blot fournit des informations plus quantitatives qu’un Western blot (moins de problème de saturation du signal)

3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs Le niveau d’expression d’un gène peut être quantifié à l’aide de gènes rapporteurs : remplacement de la portion codante du gène considéré par un gène rapporteur : - gène d'une enzyme (mesure enzymatique) - gène d'une protéine fluorescente (mesure de la fluorescence) Exemple : Remplacement de la séquence codante du gène étudié par la séquence codante d’une enzyme : la luciférase. luciférine (substrat de l'enzyme) Séquences promotrices Séquence codante du gène d’intérêt Séquence de la luciférase Mesure de l'activité enzymatique in vitro avec ajout du substrat. Ce sont des données relatives, qui doivent être comparées à une référence. Luciférase Réaction enzymatique => Emission d'un photon (quantification possible par spectrophotométrie)

3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs Activité luciférase 1 2 Gène X quatre fois plus exprimé dans la condition 1 que dans la condition 2 Exemple : niveau d’expression d’un gène X sous deux conditions différentes (1et 2) On obtient des informations sur le niveau d’expression d’un gène dans une cellule à un moment donné, pour des conditions données (résultats quantitatifs contrairement au Western blot)

3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs Ce genre de construction permet également d’analyser ce qui contrôle l’expression des protéines : Exemple : Cellules A B C D 1 2 Séquence codante du gène X Séquence codante du gène rapporteur Séquences promotrices La séquence régulatrice 1 active l’expression du gène X dans la cellule A, la séquence 2 active l’expression de X dans la cellule C

3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs Il est possible d’obtenir des animaux transgéniques exprimant les séquences promotrices d’un gène étudié fusionné à un gène rapporteur. La révélation du produit du gène rapporteur sur des embryons à différents stades apporte des informations spatiales et temporelles sur l’expression du gène étudié. Stade 1 : pas d’expression du gène Stade 2 : expression postérieure du gène Exemple :

3) Etude de l’expression des gènes : c) Localisation des protéines Comment localiser notre protéine dans des cellules ? Deux possibilités : 1) Regarder la protéine endogène par immunofluorescence 2) Construire une protéine fusionnée à une protéine fluorescente Dans les 2 cas, l'observation est faite avec un microscope à fluorescence. On peut regarder la localisation de la protéine d'intérêt dans des cellules en culture ou des coupes de tissus. Dans tous les cas, les cellules sont préalablement fixées (elles sont alors immobilisées et les macromolécules sont stabilisées et bloquées en l'état).

3) Etude de l’expression des gènes : c) Localisation des protéines : immunofluorescence Pour localiser des protéines endogènes dans une cellule (ou sur une coupe de tissu), une technique proche du Western blot est utilisée : l'immunofluorescence Cellule fixée sur lamelle et perméabilisée protéine étudiée noyau Reconnaissance de l'anticorps primaire par un anticorps secondaire fusionné à un fluorophore Analyse du signal fluorescent par observation au microscope à fluorescence => localisation de la protéine d'intérêt Détection de la protéine par un anticorps spécifique (anticorps primaire) après incubation avec de la BSA (bovine serum albumine, pour saturer les sites de liaison non spécifiques) lavages lavages noyau

3) Etude de l’expression des gènes : c) Localisation des protéines : fusion à une protéine fluorescente On peut fusionner une protéine fluorescente à l'extrêmité C-terminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt. Des plasmides contenant les protéines fluorescentes existent, et contiennent des sites de restriction permettant de cloner la protéine d'intérêt. Ex : fusion à la GFP (Green Fluorescent Protein). La GFP est une protéine issue d'une méduse Aequorea victoria, capable d'émettre une fluorescence verte après excitation par une lumière bleue. protéine d'intérêt GFP Excitation par lumière bleue Emission de fluorescence verte Localisation des protéines dans une cellule par observation au microscope à fluorescence

3) Etude de l’expression des gènes : d) Localisation des ARN et ADN Les ARN et ADN peuvent être localisés dans une cellule ou une coupe de tissus grâce à l'hybridation in situ (FISH en anglais, pour Fluorescent in situ hybridization) : Utilisation d'une sonde fluorescente d'ADN complémentaire de l'ARN ou ADN étudié et visualisation sur un microscope à fluorescence. Pour l'ADN chromosomique : les chromosomes sont préalablement exposés à un fort pH ce qui détruit les appariements de bases de l'ADN. La sonde complémentaire de la région étudiée a alors accès à l'ADN. Pour l'ARN : pas d'exposition à un fort pH pour que l'ADN reste bicaténaire et ne fixe pas la sonde. Fixation douce pour que l'ARN soit conservé dans une forme exposée.

3) Etude de l’expression des gènes : d) Localisation des ARN par Hybridation Fluorescente In Situ (FISH) Les sondes utilisées sont souvent de l'ADN. Elles sont fluorescentes. Autrefois les sondes étaient marquées radioactivement. On peut également trouvé des sondes avec un marquage chimique, détecté ensuite par des anticorps. Protocole : les sondes sont dénaturées. Elles sont incubées avec les cellules fixées et perméabilisées en présence d'ARNt et de BSA pour saturer les sites non spécifiques. Des lavages permettent d'éliminer les sondes non fixées, avant l'observation microscopique.

Conclusion : Etude de l’expression des gènes : Les analyses se font de plus en plus à une échelle globale. Exemple : les puces à ADN permettent de comparer l’ensemble des ARNm présents dans 2 échantillons différents : Collection de molécules d’ADN, spécifiques de gènes, ampifiées par PCR , puis fixées sur une lame de verre ARNm issus de l’échantillon 1 marqués par un fluorochrome rouge ARNm issus de l’échantillon 2 marqués par un fluorochrome vert Hybridation sur la lame, lavages, et analyse des signaux fluorescents Les spots rouges correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 1 que dans l’échantillon 2 Les spots verts correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 2 que dans l’échantillon 1 Les spots jaunes correspondent à des gènes exprimés de la même façon dans les deux échantillons et les spots noirs à des gènes non exprimés dans les deux échantillons

II) Utilisation de l’ADN recombinant Approche génétique classique : point de départ, des mutants avec un phénotype intéressant ; puis recherche des gènes impliqués Approche génétique inverse : développée grâce à la technologie de l’ADN recombinant ; il est possible de cibler une mutation dans une séquence donnée. Cette version mutante peut être transférée dans une cellule pour son étude (voir partie B). 4) Etude de la fonction des gènes/protéines

4) Etude de la fonction des gènes/protéines a) Approche génétique classique Mutagenèse aléatoire : par insertion (d’un transposon…), chimique… Recherche du/des gènes impliqués Test de complémentation entre mutants pour savoir si ce sont ou non les mêmes gènes impliqués Localisation du gène impliqué : Séquençage autour de l’insertion après avoir récupéré le fragment correspondant Test de liaison (position relative par rapport à d’autres gènes connus ou séquences particulières) Recherche d’homologies de séquence ; étude de l’expression du gène spatiale et temporelle Crible pour identifier un phénotype intéressant

4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse Comment est obtenue une version mutée d’un gène ? Par PCR mutagène (PCR en présence d’un déséquilibre entre les différents nucléotides et d’un tampon différent) => mutations aléatoires dans la séquence Par mutagenèse dirigée : PCR avec des amorces particulières => insertion d’une mutation à un endroit précis (exemple : modification d’un acide aminé particulier) Exemple : Séquence à muter : cag cgc gat ttc Q R D F => remplacement de l'aspartate par une alanine : Séquence de l'amorce: cag cgc gCC ttc Q R A F ADN matrice à muter : le plasmide entier avec la séquence du gène d’intérêt à muter amorces utilisées pour la PCR Zone de mésappariement de l'amorce avec la matrice, correspondant à la mutation à introduire On fait une PCR sur un plasmide entier avec des amorces présentant un mésappariement (mutation à introduire) avec la matrice

plasmide avec la mutation 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse A la fin de la PCR de la mutagenèse dirigée on se retrouve avec un mélange de plasmides initiaux sans la mutation et de plasmides contenant la mutation Le plasmide initial est méthylé car il a été amplifié dans une bactérie (méthylation de séquences d'ADN spécifiques). plasmide initial Afin de sélectionner les plasmides avec la mutation, traitement par une enzyme qui coupe des séquences d’ADN particulières seulement si elles sont méthylées, puis transformation dans des bactéries. Seul le plasmide muté, non digéré, pourra se répliquer dans les bactéries. plasmide avec la mutation

4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : différents types de mutants Mutation avec gain de fonction : souvent liée à la surexpression du gène (le gène peut être placé sous le contrôle d’un promoteur puissant, et sur un plasmide multicopies) Inactivation de gène (knockouts) Mutation effet dominant négatif : Pour une protéine entrant dans la formation d’un complexe, une mutation peut conduire au dysfonctionnement total de ces protéines, y compris des protéines non mutantes : 4 protéines associées en complexe, protéines actives 4 protéines mutantes associées en complexe, protéines inactives 1 protéine mutante dans le complexe, toutes les protéines sont inactivées

4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : utilisation des mutants Etude des phénotypes des mutants Complémentation fonctionnelle : (expériences sur des mutants conditionnels) Banque d’ADNc d’un autre organisme eucaryote, dans un vecteur levure, avec un marqueur de sélection Levures thermosensibles mutantes pour un gène X Transformation des levures, étalement sur milieu sélectif à température permissive (la mutation du gène X ne s’exprime pas) Incubation à température non permissive (la mutation du gène X s’exprime) : seules les cellules ayant une protéine qui complémente le défaut de X poussent Incubation à température permissive : toutes les cellules se développent Si restauration de la fonction X : complémentation fonctionnelle (identification d’un gène équivalent à celui muté chez la levure dans un autre organisme) Rq : ce test peut aussi mettre en évidence des gènes suppresseurs

II) Utilisation de l’ADN recombinant : Conclusion A partir de la séquence partielle en acides aminés, synthèse d’une sonde ADN, hybridation sur banque d’ADN génomique ou ADNc Protéine Gène ou ADNc Clonage dans un vecteur d’expression Production et purification de protéine recombinante