Détournement de la machinerie cellulaire par les appareils de sécrétion de type III Master 2 ICMV, 25 septembre 2008 I. Virlogeux-Payant, INRA de Tours

Plan l Rappels sur les systèmes de sécrétion chez les bactéries Gram négatives l Les appareils de sécrétion de type III

La membrane des bactéries à Gram négatif/Gram positif

La membrane des bactéries à Gram négatif

Les systèmes de sécrétion chez les bactéries Gram - 2 étapes 1 étape Sec ou tat-dependent secretion Sec-independent secretion Type V

Franchissement de la membrane interne : exportation Colin Robinson & Albert Bolhuis, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2001 Processing to mature size AND Folding Peptide signal : en N-term de la protéine, motif twin- arginin pour le système Tat, clivé

Le système Sec Système essentiel Membrane cytoplasmique Co-traductionPost-traduction ribosome SRP Protéine chaperon cytoplasme SecA SecYEG FtsY Stephenson, Mol. Membr. Biol., 2005

Les systèmes de sécrétion de type V

Système de sécrétion de type II protéines : membrane interne et externe Modèle du piston Exemple : pullulanase de K. oxytoca (Henderson, 2004, Microb. Mol. Biol. Rev.) IM OM péri cyto

Les systèmes de sécrétion chez les bactéries Gram - 2 étapes 1 étape Sec ou tat-dependent secretion Sec-independent secretion Type V

Système de sécrétion de type IV Sécrétion en 1 étape (complexe protéine-ADN A. Tumefaciens ) ou 2 étapes (toxine pertussique) Similaire au pilus pour la conjugaison bactérienne Transfert d’ADN ou de protéines de bactérie à bactérie ou bactérie/cellule eucaryote hôte  Contact dépendant (sauf toxine pertussique) (Henderson, 2004, Microb. Mol. Biol. Rev.) Effector molecule

Système de sécrétion de type I 3 parties : IM : transporteur ABC périplasme : protéine de liaison IM-OM OM : une protéine (ex : TolC) Signal de sécrétion en C-term non clivé Pas de peptide signal en N-term Translocation dans un état non replié Exemple : Hémolysine de E. coli (Henderson, 2004, Microb. Mol. Biol. Rev.) Effector molecule

Système de sécrétion de type VI (Filloux et al., 2008, Microbiology) 12 à 15 protéines dont DotU et IcmF-like Peptide signal (Sec) présent ou NON Favoriserait la persistance des bactéries pathogènes dans les cellules Exemple : T6SS de Vibrio cholerae

Plan l Rappels sur les systèmes de sécrétion chez les bactéries Gram négatives l Les appareils de sécrétion de type III

Injection de protéines effectrices Cytoplasme bactérien  cytosol cellule eucaryote Détournement de la machinerie cellulaire eucaryote au profit de la bactérie : facteurs de virulence Exclusivement chez les bactéries à Gram négatif et conservé - pathogènes respiratoires, intestinaux - pathogènes opportunistes, extracellulaires, intracellulaires obligatoires ou non… - phytopathogènes, pathogènes animaux - bactéries non pathogènes ( Rhizobium ) Gènes rassemblés en clusters : - Ilôts de pathogénicité : transfert horizontal Jusqu’à 4 T3SS différents chez une même bactérie Système de sécrétion de type III (T3SS) IM OM Eukaryotic cell membrane

Support génétique : les ilôts de pathogénicité l Grande région d’ADN (10 à 200 kb) présente chez un pathogène mais absente chez des bactéries non-pathogènes proches dans l’évolution : chromosome ou plasmide l %G+C souvent distinct de celui du reste du génôme l Loci génétiques codant les T3SS très similaires à l’intérieur d’une espèce et également chez des espèces ou des genres bactériens éloignés Venkatesan MM et al, Infect Immun, 69:3271, 2001

Li J, et al, PNAS, 92:7252, 1995 Au sein de 2 genres bactériens différents

Injection de protéines effectrices Cytoplasme bactérien  cytosol cellule eucaryote Activation complète requiert le contact avec la cellule hôte Détournement de la machinerie cellulaire eucaryote au profit de la bactérie Exclusivement chez les bactéries à Gram négatif et conservé - pathogènes respiratoires, intestinaux - pathogènes opportunistes, intracellulaires obligatoires… - phytopathogènes, pathogènes animaux - bactéries non pathogènes ( Rhizobium ) Gènes rassemblés en clusters : transfert horizontal Jusqu’à 4 T3SS différents chez une même bactérie Système de sécrétion de type III (T3SS) IM OM Eukaryotic cell membrane

T3SS : systèmes complexes l 20 à 40 protéines impliquées – Protéines de structure du T3SS : needle complex – Protéines permettant la translocation – Chaperonnes – Protéines effectrices – Régulateurs l Doivent délivrer les protéines dans la cellule eucaryote au bon endroit et au bon moment IM OM Eukaryotic cell membrane Translocon Needle complex Prot effect. Chaperonne

Hansen-Wester et Hensel, 2001 T3SS-2 codé par SPI-2 T3SS-1 Codé par SPI-1 T3SS flagellaire Entrée Survie dans vacuole d’endocytose Mobilité Adhésion T3SS chez Salmonella

Comparaison système de sécrétion-flagelle

T3SS-1 T3SS-2 Hansen-Wester & Hensel, 2001 Chez Salmonella

TTSS : systèmes complexes l 20 à 40 protéines impliquées – Protéines de structure du TTSS : needle complex – Protéines permettant la translocation – Chaperonnes – Protéines effectrices – Régulateurs l Doivent délivrer les protéines dans la cellule eucaryote au bon endroit et au bon moment IM OM Eukaryotic cell membrane Translocon Needle complex Prot effect. Chaperonne

Structure du « Needle Complex » du TTSS-1 Copyright ©2000 by the National Academy of Sciences Kimbrough, Tyler G. and Miller, Samuel I. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, PrgH PrgK InvG PrgI InvJ Tétramères de PrgH

Protéines impliquées dans la translocation (pore) Trends Microbiol 10:186, 2002 IM OM Eukaryotic cell membrane

Les chaperonnes Interaction avec les protéines effectrices sécrétées par les T3SS dans le cytoplasme de la bactérie et avec les protéines du translocon Rôles : Facilitent la sécrétion de leur substrat (effecteur, composant T3SS, régulateurs) en les stabilisant maintien dans une conformation compétente pour la sécrétion empêcher leur association prématurée dans le cytoplasme (SipBC/SicA) Notion de hiérarchie de sécrétion des effecteurs 3 classes de chaperonnes : classe Ia : lie un seul effecteur ou composant du T3SS (SicP par ex.) classe Ib : peuvent se lier à plusieurs effecteurs (InvB par ex.) classe II : liaison aux protéines du translocon (SycD, SicA) Similarité de séquence faible Caractéristiques conservées : masse moléculaire (~15 kDa), pI~5, 1 feuillet b et 3 hélices a, gènes généralement localisés à proximité d’un gène codant un effecteur

Les protéines effectrices Taille, structure, fonction très variables  de la peste chez l’homme au feu bactérien des arbres fruitiers Gènes présents sur cluster « T3SS » ou ailleurs sur le génôme (phages notamment) Fonction directe anti-hôte OU « aides » à la sécrétion et translocation des effecteurs anti-hôte  Manipuler la physiologie, les fonctions cellulaires de l’hôte Comment ? Similarité avec une protéine eucaryote et même fonction Séquence primaire différente mais conformation et fonction identique à une protéine eucaryote Fonction identique à une protéine eucaryote même si structure différente

l Peuvent présenter des similarités de séquences avec protéines effectrices d’autres genres bactériens – Fonction identique Ex : - ExoS de P. aeruginosa et YopE de Yersinia – Fonction différente » SptP de S. Typhimurium et YopE-YopH de Yersinia » cas particulier : SipB de S. Typhimurium et IpaB de Shigella Les protéines effectrices

- empêcher la phagocytose ( Yersinia spp.) - effet cytotoxique ( Yersinia ) - Lyser la vacuole d’endocytose ( Shigella, Ipa) - apoptose du macrophage ( Shigella, Salmonella ) - favoriser l’entrée dans les cellules ( Shigella, Salmonella par ex.) - permettre la survie et multiplication intracellulaire ( Salmonella par ex.) - attachement/effacement E. coli EPEC - Avirulence et réponse hypersensible ( Erwinia) - Suppression voie d’activation transcriptionnelle des microRNA Exemples d’effets des effecteurs YopH YopE Sip Intimine/Tir IpaB

T3SS-1 chez Salmonella : Entrée dans les cellules épithéliales intestinales D’après Ginocchio et al, 1994 Réarrangements du cytosquelette

Coopération de SipA et SipC dans l’induction des réarrangements de l’actine McGhie et al., 2001

T3SS-2 : Survie et multiplication dans les celluleshttp:// Important pour la dissémination systémique de l’infection

SpiC exclut TassC de la vacuole d’endocytose Lee et al., 2002

Survie de Salmonella en fonction de l’expression de TassC

Avirulence et «hypersensitive response» chez les bactéries phytopathogènes Plantes sensibles Maladie Plantes résistantes Erwinia wt tampon Mutants type III Mutants complémentés

Suppression de l’activation transcriptionnelle des microRNAs Navarro et al., Science, 2008

Schkora et al., Plos One, 2008 Salmonella : un pathogène de plante

Régulation de l’expression des T3SS et de la sécrétion l Problème : Précision spatiale et temporelle de la sécrétion des protéines effectrices l Solutions : – Utilisation de systèmes de sécrétion multiples – Contrôle transcriptionnel : »Notion de hiérarchie dans l’assemblage des T3SS »Synthèse des protéines effectrices à effet tardif – Contrôle post-traductionnel

Appareilde sécrétion Effecteurs TTSS-1 Chaperons Modèle simplifié de régulation de SPI-1 Régulateurs InvF HilA + + Transcription d’abord des gènes de structure puis des gènes codant les effecteurs

Mise en place d’abord du corps basal et du crochet puis transcription des gènes codant protéines du filament, mobilité et chimiotactisme

l Sécrétion des effecteurs précoces IpaB et IpaC  Augmentation de chaperonnes libres (IpgC)  Co-activation de la transcription d ’ipaH avec MxiE Expression des effecteurs tardifs  Le taux de chaperonnes libres sert d’indicateur pour la bactérie

Host cell cytopl. Bacterial cytopl. Thomas et Finlay, 2003 Sécrétion hiérarchique des protéines par les T3SS (2) LcrQ YopH SycH

Résumé l Les T3SS sont des systèmes de sécrétion multi-protéines qui connectent la bactérie avec la cellule hôte l Ils médient la sécrétion et la translocation des protéines du cytoplasme bactérien vers le cytosol de la cellule hôte l Les protéines effectrices détournent les fonctions cellulaires l Etude des T3SS importante pas uniquement pour la pathogénie bactérienne mais également pour la biologie cellulaire eucaryote “Bacteria are excellent cell biologists” Stanley Falkow