La Spectrométrie de masse: Un outil de pointe à la portée de tous

Histoire 1897 Sir J.J. Thomson (Cavendish Laboratory of Cambridge) Prix Nobel de Physique 1906 Arrivée dans les laboratoires de diagnostic clinique dans les années 80-90

Généralités Technique analytique physique permettant de séparer des molécules sous forme d’ions suivant leur rapport masse/charge (m/z) Intérêt : Détermination de masse moléculaire Identification structurale Quantification

Structure d’un spectromètre de masse (MS)

Structure d’un spectromètre de masse (MS) Fonction de la source d’ionisation: Molécules neutres  Ions Plusieurs types: Ionisation douce: ElectroSpray Ionization (ESI), Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), Chemical Ionization (CI) Ionisation dure: Electronic Impact (EI) - +

Structure d’un spectromètre de masse (MS) Fonction: sélectionner les ions selon leur rapport m/z Plusieurs types d’analyseurs: Quadrupôle Temps de vol (TOF) Combinable entre eux: Triple quadrupôle, Q-TOF, TOF-TOF… +

Structure d’un spectromètre de masse (MS) + Fonction: détecter et compter les ions produits par la source et transmis par l’analyseur Plusieurs types de détecteurs existent +/- sensible et durable

Structure d’un spectromètre de masse (MS) Fonctions: Gérer la communication avec les modules de l’appareil Traduire les données du détecteur en Spectre de masse Identifier les molécules (via la banque de données) et/ou les quantifier

Couplage à la chromatographie GC/LC Intérêt : Décomplexifier le mélange ↑ Spécificité (intérêt +++ si matrice = sang / urine) ↓ Interférences 2 types de chromatographies: Chromatographie Phase Gaz (GC): adaptée aux petites molécules volatiles <600-800 Da (GC-MS) Chromatographie Phase Liquide (HPLC ou UPLC) adaptée aux molécules de polarités différentes (LC-MS)

Exemple d’un GC-MSMS en mode MRM Cellule de Collision Q2 Precursor ion Product ion Fragmentation Q1 Fixe Q2 Fixe Exemple: Pour la créatine la transition MRM est 188>90 (Da)

Au quotidien : Démarrage Les maintenances de l’appareillage: Plusieurs niveaux de formation = plusieurs niveaux de qualification Maintenance LC / MS Fréquence Formation Technicien utilisateur Technicien référent / Ingénieur Changement phase mobile + Colonne Quotidienne Rapide Nettoyage entrée source d’ionisation Amorçage + Mise en équilibre du système + rinçage injecteur Contrôle du fonctionnement du système / identification de panne Moyenne Intervention pompe LC / injecteur Curative 2/an Calibration Analyseur après PM Curative

Au quotidien Screening/identification : Mélange test Dosages : Calibration en 3 points minimum Passage de contrôles encadrant la série de patients Logiciel de gestion des contrôles Points importants : Matrice CAL et CQ en rapport avec l’échantillon Etalons internes marqués s’ils existent

Etalon interne Quantification : Aireanalyte/AireEI Molécule(s) connue(s) ajoutée(s) en concentration connue en début de manipulation. Sa réponse mesurée permettra de : Compenser les fluctuations analytiques (préparation, injection, détection) Témoigner du bon déroulement de l’analyse du début de la manipulation jusqu’à la détection de l’analyseur. Quantification : Aireanalyte/AireEI

Etalon interne Compatible avec le traitement de l’échantillon (précipitation, extraction liquide, solide,…) Comportement et propriétés physico-chimiques similaires à la molécule analysée. Molécule Native: Isotope marqué : O-toluidine O-toluidine D9 MM = 107 g/mol MM = 116 g/mol ΔM= 9 Da

Etalon interne Ex : Lacosamide Temps de Rétention similaires : Repère Ionisation identique Lacosamide quantification Lacosamide qualification Lacosamide d3

Applications: Toxicologie: Screening large et/ou dosage de différents xénobiotiques (médicaments, stupéfiants, marqueurs d’exposition professionnels, métaux…) Intérêt +++ en médecine légale Métabolisme: Etablissement de profils métaboliques / dosage des métabolites endogènes (Acides aminés, Acides organiques, Acylcarnitines, Acides gras, Acides biliaires, Créatine et Guanidinoacétate) Microbiologie: Identification des souches bactériennes Immunologie: Dosage des immunosuppresseurs (anti-rejet tel que Everolimus) Endocrinologie: Dosage des stéroïdes sanguins et urinaires, dosage de la Vitamines 1,25 OH D2 ou D3

Métabolisme Exemple de la chromatographie des acides organiques urinaires en GC-MS/Détecteur à ionisation de Flamme (FID): Traitement de l’échantillon Injection de l’extrait sur le GC  Chromatogramme + Spectres de masses Etablissement du profil qualitatif en MS  Diagnostic clinique Quantification des métabolites d’intérêt en FID  Diagnostic + Suivi

Métabolisme

Métabolisme Métabolisme basal

Métabolisme Activation de voies Marqueurs spécifiques de la pathologie Activation de voies métaboliques secondaires

Métabolisme

Endocrinologie: Evolution des méthodes immunologiques / Radio-immunologiques vers la LC-MSMS: ↑ spécificité +++ car éviction des réactions croisées Ag/Ac ↑ sensibilité +++ (résultat au ng/ml) ↓ coûts : kits ELISA, RIA €€, élimination des déchets radioactifs €€€ , possibilité de regroupement des analyses en profil ↓ volume de sérum nécessaire chez les nouveaux nés car profil établi en 1 seule prise d’essai (300 µL)

Endocrinologie:

Microbiologie Utilisation d’un MALDI-TOF en routine pour l’identification des souches bactériennes Co-cristallisation de la matrice avec une colonie bactérienne isolée

Microbiologie Etablissement d’un spectre des protéines de la souche bactérienne Comparaison avec les spectres de la banque de données (fournie par le fabricant)

Validation de méthode de dosage Linéarité : Modèle linéaire, quadratique, … Limites méthode : LOD/LOQ et limite de linéarité haute Répétabilité : même série, même opérateur Fidélité intermédiaire : Reproductibilité inter-série… Contamination inter-échantillons Sélectivité / interférences Justesse Incertitudes (CV)

Préparation d’échantillon Intérêt: dépend de la molécule et de son environnement Elimination de substances: Augmentant le bruit de fond (interférents) Modifiant la réponse (effet matrice) Encrassant l’analyseur (Polluants) Concentration (si recherche de sensibilité) Mise en condition de l’analyte pour le rendre analysable (dérivation, transfert dans un solvant compatible avec analyseur, co-cristallisation pour MALDI…)

Préparation d’échantillon Dosage de CAO en GC/MS-FID: 1 mL d’urine (ou dilution si Créatinine >1 mM) 30 µL de solution d’étalons internes (2-Phenylbutyrate+ C17:0) 200 µL HCL 2,4N NaCl jusqu’à saturation Triple extraction Liquide / Liquide à l’Acétate d’éthyle (Agitation 1 min, Centrifugation, décantation) Evaporation de la phase organique Dérivation 45 minutes à 80°C Run = 45 min Temps de traitement des données: 20-30 minutes

Préparation d’échantillon Dosage de metformine : 50 µL de sérum 300 µL de précipitant + étalon interne Centrifugation 10 min à 20 000 g Reprise de 20 µL de surnageant + 180 µL de PM Run = 3 min Tps 1 échantillon < 15 min Tps 10 échantillons < 25 min Intérêt fonctionnement en série

Dosage Possibilité transfert  SIL Tableau de résultats Transition de quantification Transition de qualification Transition de quantification EI Calibration Transition de qualification EI

Conclusion Technique de référence pour de nombreux dosages Outil indispensable en laboratoire d’analyses médicale gain de spécificité et sensibilité Maintenance de base et utilisation accessible Avenir : métabolomique, protéomique…

Merci de votre attention!