EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE À PARTIR DE CELLULES VIVANTES

EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE But Préparer l’ADN génomique à partir de cellules végétales, spécifiquement celles de kiwi.

EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE Objectifs pratiques exposition aux techniques de lyse cellulaire exposition aux techniques d'extraction d'ADN utilisation d'une microcentrifugeuse

EXTRACTION D’ADN GÉNOMIQUE Objectifs pratiques déprotéinisation d'une préparation d'ADN par extraction phénol/CHCl3 précipitation d'ADN avec de l'éthanol dosage de l'ADN (A260 et A260/A280)

LES ACIDES NUCLÉIQUES Deux classes désoxyribonucléique (ADN) ribonucléique (ARN) ADN Réplication Transcription ARN Traduction Protéine

LES ACIDES NUCLÉIQUES ADN hélice double monotone (= double brins) associé à plusieurs protéines (histones) sous la microscope électronique nucleosome

LES ACIDES NUCLÉIQUES nucleosome l’unité de base de la chromatine 1e niveau de compaction de l’ADN composé des histones + ADN

LES ACIDES NUCLÉIQUES ADN dépositaire de l'information génétique génome = ensemble des chromosomes localisés dans le noyau d'une cellule seulement deux rôles: 1. diriger sa réplication lors de la division cellulaire 2. diriger la transcription d'ARNm complémentaire

LES ACIDES NUCLÉIQUES ADN - rôles ADN Réplication Transcription ARN Protéine Traduction Transcription Réplication

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE plusieurs méthodes choix dépend du matériel à extraire 3 étapes principales lyse cellulaire séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires précipitation (concentration) de l’ADN

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau  mécanique  à l’aide de détergents N.B. Les détergents (ex. SDS) dénaturent les protéines et solubilisent les membranes. peuvent être combinés

EXTRACTION d'ADN de KIWI Les cellules de kiwi possèdent une paroi cellulaire ( = barrière physique) qu’il faut détruire pour être capable d’isoler l’ADN génomique des noyaux des cellules.

EXTRACTION d'ADN de kiwi paroi cellulaire

EXTRACTION d'ADN de KIWI Bris de la paroi cellulaire écrasement par fourchette (lyse physique) tampon de lyse avec détergent (chimique)

CELLULES ANIMALES Pas de paroi : Alors, ne nécessite pas de bris mécanique des fois un tampon hypotonique suffit pour faire éclater la cellule

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires  filtration ou centrifugation du lysat cellulaire  extraction des protéines (phénol/CHCl3)

EXTRACTION d'ADN GÉNOMIQUE lyse cellulaire: libère l’ADN du noyau séparation de l’ADN des autres composantes cellulaires précipitation (concentration) de l’ADN  précipitation à l’éthanol  colonne d’affinité (au lieu de précipitation, trousses commerciales) À noter: dans le cas des trousses utilisant une colonne effectivement les étapes 2+3 sont combinées.

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ 1. Estimation de la [ADN] par A260 à l’aide du spectrophotomètre bases azotées de l’ADN absorbent à 260 nm ADN doit être si pur 1 A260 = 50 µg/ml d’ADN double brin

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ 1. Estimation de la [ADN] par A260 Problème: les protéines absorbent à 280 nm le phénol absorbe à 270 nm peut causer surestimation de [ADN] en raison de l'absorbance résiduelle à 260nm

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ 1. Estimation de la [ADN] par A260 Solution: mesurer A280 calculer le rapport A260/A280 donne une indication de la pureté de l’ADN (±)

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ 1. Estimation de la [ADN] par A260 Point technique: il faut que les lectures de A se situent entre 0,05 et 2,0 pour être fiables (au 2 λ)

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ 2. Intégrité de l’ADN spectrophotométrie donne aucune information sur l’intégrité de l’ADN (c.-à-d. dégradé ou non) Pourquoi? Parce que, même si l'ADN est dégradé, les bases azotées de l'ADN sont encore présentes et absorbent à 260 nm

QUALITTÉ/QUANTITÉ de l’ADN PRÉPARÉ 2. Intégrité de l’ADN souvent on utilise un gel d’agarose pour visualiser la qualité de l’ADN (permets aussi d’évaluer [ADN]) migration

direction de la migration GELS d'AGAROSE Un exemple de BCM111: ADN génomique Pas de traînée = ADN non-dégradé ! direction de la migration

GELS d'AGAROSE Un exemple de BCM111: ADN génomique Pas de traînée = ADN non-dégradé ! ARN

SÉCURITÉ 1. Phénol très corrosif peut causer des brûlures Alors, les précautions: porte de gants porte de sarrau porte de lunettes de protection travailler le plus possible sous la hotte

SÉCURITÉ 1. Phénol très corrosif peut causer des brûlures S’il y a contact de phénol/CHCl3 avec la peau: rincer avec beaucoup d’eau ensuite laver avec de l’eau et du savon ne jamais utiliser d’éthanol

SÉCURITÉ 1. Phénol récupération sous la hotte ne jamais mettre des Eppendorfs contenant du ɸOH dans les poubelles ordinaires

SÉCURITÉ 1. Phénol récupération sous la hotte ne jamais mettre des Eppendorfs contenant du ɸOH dans les poubelles ordinaires portez attention de ne pas confondre la bouteille de ɸOH /CHCl3 et les déchets

SÉCURITÉ 2. Microcentrifugeuse lire/comprendre les règles d’utilisation sur p.7. équilibrer vos tubes !

SÉCURITÉ 2. Microcentrifugeuse lire/comprendre les règles d’utilisation sur p.6. équilibrer vos tubes = mettre un tube équilibre en face de votre tube pour les microtubes un volume égal est souvent acceptable

SÉCURITÉ 2. Microcentrifugeuse si le rotor n’est pas balancé… La soucoupe volante vue hier était en fait un rotor débalancé.

SÉCURITÉ 2. Microcentrifugeuse si le rotor n’est pas balancé…

SÉCURITÉ 2. Microcentrifugeuse s'il y a un bruit bizarre, immédiatement arrêter la centrifugeuse et vérifier

SÉCURITÉ 3. acides nucléiques en général Alors, les précautions: dégradés par les nucléases, des enzymes qui se retrouvent partout (sur nos mains, etc.) Alors, les précautions: solutions, embouts et tubes stériles porte de gants (très important pour l’ARN)

SÉCURITÉ 3. acides nucléiques en général À noter: uniquement cette semaine on travaille avec des embouts stériles, alors SVP ne pas remplir les boîtes avant qu'elles soient vides (mettre à l'endroit indiqué) embouts/microtubes au buffet (retournez-les à la fin de la journée)

PLAN EXPÉRIMENTAL 1. EXERCICE 1 Extraction de l’ADN génomique de kiwi. 2. EXERCICE 2 Dosage de l’ADN (A260 + A260/A280)

ORGANIGRAMMES aide visuel en laboratoire montre les grandes lignes ne pas inclure tous les détails pour l'extraction d'ADN de kiwi à mettre dans le cahier avant le labo

Faire l'extraction avec seulement 500ul du SN

Lunettes et gants obligatoire POINTS TECHNIQUES Lunettes et gants obligatoire Extraction d'ADN génomique Kiwi

POINTS TECHNIQUES Extraction d'ADN génomique Kiwi n'oublier pas de peser votre ¼ de kiwi! n'oublier pas de mélanger pendant les incubations à 60oC et sur glace noter le volume de votre filtrat (étape 6, pipette de 10ml stérile) utiliser seulement 1 ml de votre filtrat pour continuer (étape 7) Attention: à la fin, tout l'ADN obtenu provient de 500ul du filtrat (important pour calculs)

POINTS TECHNIQUES Extraction d'ADN génomique Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: éviter de prendre de l'interphase

POINTS TECHNIQUES Extraction d'ADN génomique Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: gardez le tube à un angle en la sortant de la microcentrifugeuse

POINTS TECHNIQUES Extraction d'ADN génomique Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: gardez le tube à un angle en la sortant de la microcentrifugeuse enlevez la phase aqueuse le plus vite possible

POINTS TECHNIQUES Extraction d'ADN génomique Kiwi prélèvement de la phase aqueuse: éviter de prendre de l'interphase l'ADN est le matériel clair et gélatineux collé sur le bord de l'Eppendorf ne pas mélanger EtOH 70% et 95%

POINTS TECHNIQUES Estimation des petits volumes à l'aide de la micropipette essai et erreur

POINTS TECHNIQUES Culots d'ADN portez attention de ne pas les perdre portez attention de bien les dissoudre vérifier en regardant au travers du tube s'il n'y a plus de culot transparent et gélatineux sinon, mélanger la solution, car une solution non-homogène est nuisant à la quantification

SPECTROPHOTOMÉTRIE

SPECTROPHOTOMÉTRIE Côté rayé 3 ml 1 ml Volume minimal utiliser les côtés rayés des cuvettes pour les manipuler (cuvettes UV) essuyer les cuvettes avec un kleenex faire un blanc à toutes les longueurs d’onde

A = Ecl SPECTROPHOTOMÉTRIE Loi de Beer-Lambert: A = absorbance (pas d'unités) E = coefficient d'extinction molaire(M-1cm-1) c = concentration (M) l = longueur (cm) A = Ecl

A = Ecl SPECTROPHOTOMÉTRIE Loi de Beer-Lambert: l'absorbance (A) varie en fonction [ADN] c.-à-d pour 2 échantillons d'ADN « E » et « l » ne changent pas A = Ecl

POINTS TECHNIQUES Spectrophotométrie bien identifier vos cuvettes! A entre 0,05 et 2,0 pour être fiable (2 λ)

POINTS TECHNIQUES Ex. spectrophotométrie A entre 0,05 et 2,0 pour être fiable 10ul échantillon+990ul H2O donne A = 2,2 Qu’est-ce qu’il faut faire ? diluer 1:2 ou utiliser seulement 5 ul

COMPTE RENDU TSB103 compléter les feuilles du compte rendu dans vos notes de cours pourrait être fait en laboratoire remettre à l’heure normale

QUESTIONS?