Etude des interactions entre le chitosane et diverses souches bactériennes en milieux aqueux. DEA « Chimie et Microbiologie de l ’Eau » Laurence Giraud Encadrant : Yves Andres Maître assistant, HDR

PLAN DE LA PRESENTATION Introduction Généralités sur la chitine et le chitosane Généralités sur les bactéries Cinétiques de mortalité Matériels et Méthodes Caractérisation des matériaux Etude de la survie des bactéries dans divers milieux Approche mécanistique Résultats et Discussion Spectres IR-TF et Titrages acido-basiques Courbes de survie des bactéries dans divers milieux Approche mecanistique Conclusion et Perspectives

INTRODUCTION Dispersion des micro-organismes résistants par les installations traitant l ’eau (Gerba et al., 2003) Aeromonas Hydrophila (E.P.A.) 103-104 UFC/mL dans eaux de surface 102-103 UFC/mL dans les réseaux de distribution Toxicité des produits de désinfection actuels (Chlore, dioxyde de chlore, ozone) Exemple : le dioxyde de chlore est capable de se combiner à la matière organique du milieu et de former des composés aromatiques chlorés nocifs Afin de pallier à ces problèmes techniques de mises en œuvre, utilisation du chitosane pour le traitement des eaux. L ’E.P.A. a déjà approuvé l ’usage du chitosane dans l ’eau (jusqu ’à 10 mg/L) But de l ’étude : Etudier les interactions et les effets entre le polymère et les souches bactériennes : deux Gram-négatives, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa, et deux Gram-positives, Staphylococcus saprophyticus et Enterococcus faecalis

Généralités sur la chitine et le chitosane INTRODUCTION Généralités sur la chitine et le chitosane Structures moléculaires de la chitine (a) et du chitosane (b). CH 3 C O CH 2 OH NH CH 2 OH O O HO O O O HO O HO O CH 2 OH NH NH (a) C O C O CH 3 CH 3 (b)

Généralités sur la chitine et le chitosane INTRODUCTION Généralités sur la chitine et le chitosane Propriétés et caractérisation Analyses physiques du chitosane polymère très peu poreux Analyse infra-rouge Nombres d’onde caractéristiques (cm-1) des principales vibrations amines et amides des polymères. DA = (Harish Prashanth et al., 2002) ; DA = (Khor, 2001) Comportement acido-basique du chitosane % NH2 = (Broussignac, 1968 ; cité par Saucedo, 1993)

Généralités sur les bactéries La paroi bactérienne INTRODUCTION Généralités sur les bactéries La paroi bactérienne Comparaison des enveloppes des bactéries Gram-positives et Gram-négatives (Maier et al., 2000).

Cinétiques de mortalité Le modèle de Chik-Watson (Montgomery, 1985) INTRODUCTION Cinétiques de mortalité Le modèle de Chik-Watson (Montgomery, 1985) ln = -Kt N = nombre de micro-organismes présents au temps t, N0 = nombre de micro-organimes présents au temps 0, K = constante caractéristique du type de désinfectant, des micro-organismes et de l’aspect de la qualité de l’eau du système (min-1), t = temps (min).

Caractérisation du matériel utilisé MATERIELS ET METHODES Caractérisation du matériel utilisé Analyse infra-rouge Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF (pastillage de l ’échantillon) Titrages acido-basiques des polymères Dissolution des polymères dans de l ’acide chlorhydrique 0.1M et dosage par la soude Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux Dans l ’eau déminéralisée Dans une suspension de chitosane déacétylé à 80 % Influence du degré de déacétylation du chitosane Influence de la concentration en chitosane déacétylé à 80 % Etude mécanistique Intégrité des couches pariétales Libération de protons Libération d ’ions potassium Force ionique

Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux MATERIELS ET METHODES Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux Protocole de numération des colonies ensemencement réacteurs (2 duplicats par milieux) : eau déminéralisée, suspension de chitine, suspension de chitosane déacétylé à 60 % et suspension de chitosane déacétylé à 80 %

RESULTATS ET DISCUSSIONS Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymères Analyses des spectres infra-rouge Spectres infra-rouge de la chitine et du chitosane (déacétylé à 80 %). Détermination du degré d’acétylation (+/- 5 %) à partir de l’analyse des spectres infra-rouge (les résultas représentent les valeurs moyennes des duplicats).

RESULTATS ET DISCUSSIONS Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymères Analyses des titrages acido-basiques Titrage acido-basique du chitosane (France Chitine). Comparaison des taux de déacétylation des polymères selon la méthode d ’analyse Comparaison des taux de fonctions aminées (%) du chitosane et de la chitine selon la méthode d’analyse utilisée.

Etude de la survie des MO dans divers milieux RESULTATS ET DISCUSSIONS Etude de la survie des MO dans divers milieux Exemple de courbe de survie obtenue pour les quatre souches de bactéries : E. coli (), P. aeruginosa (), E. faecalis (), et S. saprophyticus (), dans l’eau déminéralisée en présence de chitosane (80 %). Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau déminéralisée, suspension contenant du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine. Chitosane (80%) Chitosane (60%) Chitine E. coli -6,00E-04 -905,00E-04 -227,00E-04 6,00E-04 P. aeruginosa -12,00E-04 -132,00E-04 9,00E-04 E. faecalis. -25,00E-04 -367,00E-04 1,00E-04 S. saprophyticus (ds NaCl) -16,00E-04 -281,00E-04 -50,00E-04 3,00E-04 Eau Déminéralisée Eau déminéralisée additionnée de polymères

Etude de la survie des MO dans divers milieux RESULATS ET DISCUSSIONS Etude de la survie des MO dans divers milieux Influence de la concentration en chitosane Courbe représentant les constantes de mortalité de E. coli selon la concentration en chitosane déacétylé à 80 %.

Approche mécanistique Intégrité des couches pariétales RESULTATS ET DISCUSSIONS Approche mécanistique Intégrité des couches pariétales Concentrations en Carbone Organique Dissout dans trois milieux différents avec E. coli (mg.L-1). Libération des ions potassium Courbes représentant les constantes de mortalité de Escherichia coli selon la quantité de K+ rejetés (a) et la quantité en ions potassium libérés dans le milieu pour différentes concentrations en polymère (b).

RESULTATS ET DISCUSIONS Approche mécanistique Influence de la présence d ’ions dans le milieu L ’eau de source permet de voir un effet possible de la présence d ’ions dans le milieu sur la mortalité de E. coli Composition ionique de l’eau de source Sainte-Aude (mg.L-1). Chitosane (80%) Chitosane (60%) Chitine E. coli -6,00E-04 -17,00E-04 -29,00E-04 -8,00E-04 Eau de Source Eau de source additionnée de polymères Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau de source, suspension contenant du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES Effet antibactérien du chitosane Action différente sur les quatre souches de bactéries, mais pas de comparaison notable entre mortalité des Gram-négatives et mortalité des Gram-positives Rôle majeur des fonctions NH2 du chitosane dans la diminution de la population bactérienne Interaction probable entre les fonctions amines libres du chitosane et des groupements fonctionnels des bactéries Les cellules ne se lysent apparemment pas Possibilité de réutiliser le polymère après réalisation d ’une première cinétique de mortalité D ’autres études nécessaires à la caractérisation de la mortalité des cellules Utilisation du polymère dans le traitement des eaux