F.harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, F.Zerhouni, R.M.Hamladji. Identification de la mutation Jak2V617F dans les syndromes myeloprolifératifs F.harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, F.Zerhouni, R.M.Hamladji.

Syndromes myeloprolifératifs Similitudes cliniques et biologiques Origine commune: CSH hyperplasie myéloïde globale hypersensibilité voire indépendance des progéniteurs hématopoeitiques aux facteurs de croissance. Classification OMS: semi moléculaire SMP atypiques leucémie neutrophile chroniq mastocytose systémique leucémie éosinophile chroniq SHE SMP classiques: SMP BCR-ABL+: LMC SMP BCR-ABL neg: P.V, TE, MFP Jak2 V617F

CASCADE DE SIGNAUX DE PROLIFERATION: Mutation Jak2V617F…? Jak2: famille Janus kinases (Jak1,Jak2,jak3,Tyk2) TK associée R-EPO, MPL, R-G-CSF Fonction: régulation de l`expression des gènes en réponse aux cytokines. Jak-STAT migration vers le noyau CASCADE DE SIGNAUX DE PROLIFERATION:

Mutation Jak2V617F Structure des tyrosine kinases Jak KB JH1 JH2 FERM SH2 domaine pseudo Kinase Src homology 2 domaine Kinase YY R-EPO interacting domain Mutation Jak2V617F Gène cloné 1989: 9p24 Mutation JH2 Substitution G……T nt 1849 Changement Val…..Phe au codon 617 Jak2 V617F Mutation acquise, unique,clonale CSH: cellules myéloïdes (PN, EB, pqt) Absente des Ly T Jak2 muté: pas d`inhibition par le domaine JH2 activité kinase constitutivement active, indépendante de la fixation du ligand sur son récepteur….activation signaux en aval.

Jak2 et oncogenèse Protéines de fusion: SMP atypiques : t(8;9)(p21;p24) PCM1-JAK2 t(9;12)(p24;p13) JAK2-ETV6 t(9;22)(p24;q11.2) JAK2-BCR Perte du domaine de fixation aux récepteurs de cytokines (FERM) pas de gain de fonction !!!

Fréquence de la mutation JAK2 Auteur PV TE MF Kralovics 65%(27%) n=128 23%(3%) n=93 57%(22%) n=23 James 89%(30%) n=45 43% n=21 n=7 Levine 74% (25%) n=164 32% (3%) n=115 35%(9%) n=46 Baxter 97%(26%) n=73 57%(0%) n=51 50%(19%) n=16 Différences de fréquences: Stringence des critères de diagnostic de PV, La sensibilité des méthodes de détection de la mutation, La source de l`ADN (PN..!!!)

Méthodes de détection Auteur Référence Méthode Cellules Kralovics NEJM Séquencage PN James Nature Levine cancer cell Baxter Lancet AS-PCR Jones Blood Sang total Mc Clure Leukemia Melting curve assay Passamonti Real time AS-PCR Blood mai 2006 Q-PCR

Patients (n=59) Fev 2010 – mars 2011. 22 (37%) Patients traités HU; …….. BCR-ABL neg. SMP Ph- (n=45) SMP? (n=14) Total (n=59) PV 16 (35.5%) - 16 (27%) TE 23 (51%) 23 (39%) MFP 6 (13%) 6 (10%) Budd-Chiari 8 (57.14) 8 (13.5%) Suivi médian(an) 3 [1 - 9] 3 [1 – 9] Age (médiane) 48 [24 – 75] 33 [30 – 60] 48 [24 - 75] Sexe ratio (h/f) 18/27 (0.66) 5/8 (0.62) 23/34 (0.7)

Échantillons biologiques Sang total: EDTA 0.34M PN+++: Ficoll+lyse totale GR 3 étapes: Extraction d`ADN (QiagenTM)…..10ng/ul Amplification: PCR: Seeplex Jak2 genotyping Kit. « primers DPO » - Gène sauvage (WT) - Gène muté 35 cycles Visualisation des produits de PCR (E-se gel d`agarose à 2% +BET)…..UV 800pb (contrôle int) 600pb (non muté) 300pb (muté)

Résultats: PV (n=16) 11 (68.75%) - 11 (18.6%) TE (n=23) 3 (13%) 3 (5%) SMP Ph- (n=45) SMP? (n=14) Total (n=59) PV (n=16) 11 (68.75%) - 11 (18.6%) TE (n=23) 3 (13%) 3 (5%) MFP (n=6) 1 (16.6%) 1 (1.7%) Budd-Chiari (n=8) 3 (37.5%) 3 (13.5%) 15 (33.3%) 3 (21.4%) 18 (30.5%)

Résultats Mutations à l`état hétérozygote: 2 situations: Allèle muté +allèle WT PN normaux PN malins

Commentaires 3 implications: Affirmer le diagnostic de SMP au même titre que BCR-ABL, 1er examen à effectuer devant: Polyglobulie, .évaluation initiale + EPO sérique. (critère majeur) Thrombocytose, Hyperleucocytose d`étiologie non évidente. Budd-Chiari (thromboses révélatrices de SMP) Rapport Jak2V817F/Jak2WT dans les PN: élément pronostique évolution vers myelofibrose TE,PV Développer thérapeutiques de type ITK: ciblées Jak2 muté.

PCR Spécifique, sensible Reproductible Multiplex: coamplification des 2 allèles Jak2 (sauvage et muté) ………… 1 seule étape Rapide: 1 jour (5 heures). Contrôle interne d`amplification (intégrité ADN: reprentativité) Marqueur de taille intégré. Mais: Faux négatifs: Coexistance de PN issus de CSH non mutée et PN issus de CSH mutée. Nature du matériel cellulaire testé (lyse cellulaire) traitements antérieurs: diminution de la charge de l`allèle muté.