L’amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR) Technique de biologie moléculaire (1985) Avant ? Isoler la séquence Clonage Amplification dans une cellule hôte Purification Méthode lourde et longue

PCR Technique de réplication ciblée in vitro Page 16 Technique de réplication ciblée in vitro Elle permet d’obtenir à partir d’un échantillon peu abondant ou impure, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN. Ordre de grandeur: milliards de copies en quelques heures

PCR (principe) Page 16

PCR Page 17 Principe Réaliser une succession de réplication d’un fragment d’ADN double brin (ADN polymérase – amorce) Où? Dans un tube lui-même placé dans un appareil programmable = thermocycleur

PCR Le thermocycleur Placer le tube aux températures voulues pendant des durées programmées (cycles). Un cycle reproduit 3 températures différentes pendant des durées différentes. Durée d’un cycle = 2-3 minutes environ.

PCR Les acteurs: ADN à amplifier Pages 17-18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

Présents en excès par rapport à l’ADN PCR Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4) Présents en excès par rapport à l’ADN

PCR Les acteurs: ADN à amplifier Page 17 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

PCR Page 17 ADN à amplifier:

PCR

PCR Les acteurs: ADN à amplifier Page 18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

PCR 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques Page 18 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques Petits brins d’ADN ~ 20 bases

PCR 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques Rôles ? Page 18 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques Rôles ? Délimiter la région d’ADN à amplifier Extrémités 3’ libre servent d’amorce pour l’ADN polymérase Il faut connaître les séquences nucléotidiques des extrémités

PCR Les acteurs: ADN à amplifier Page 18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

PCR ADN polymérase = Taq Polymérase (Taq Pol) Page 18 ADN polymérase = Taq Polymérase (Taq Pol) ADN polymérase thermorésistante (Thermus aquaticus) Température optimale d’action = 72°C (95°C)

PCR ADN polymérase Fonctionnement: Lecture du brin matrice 3’ → 5’ Page 18 ADN polymérase Fonctionnement: Lecture du brin matrice 3’ → 5’ Synthèse du nouveau brin complémentaire 5’ → 3’

PCR 3’ 5’ 3’ 5’

PCR Les acteurs: ADN à amplifier Page 18 Les acteurs: ADN à amplifier 2 amorces (« primer ») monocaténaires spécifiques ADN polymérase Désoxyribonucléotides (4)

PCR Désoxyribonucléotides (4) 4 sortes: - A = adénine - T = thymine - G = guanine - C = cytosine

PCR Page 18 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

PCR Page 18 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

PCR

PCR Page 18 Dénaturation: Le tube est chauffé qq secondes à 94°C

PCR Page 18 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

PCR Hybridation (durée = 1 minute): ↓ T°C rapidement à 55°C (40-65°C) Page 18 Hybridation (durée = 1 minute): ↓ T°C rapidement à 55°C (40-65°C) Les amorces « reconnaissent » leur séquence complémentaire sur les brins cibles ou matrices. Hybridation (= fixation)

PCR Page 18

PCR Page 19 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes différentes (températures différentes) Dénaturation Hybridation Elongation

PCR Elongation (durée = 1 minute): ↑ T°C à 72°C Page 19 Elongation (durée = 1 minute): ↑ T°C à 72°C La Taq Polymérase ajoute des désoxynucléotides aux amorces hybridées (5’→ 3’) en lisant le brin matrice dans le sens inverse (3’ → 5’)

PCR Page 19

PCR Page 20 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles

PCR 1er cycle: Synthèse de brins complémentaires Page 19 1er cycle: Synthèse de brins complémentaires Plus court que le brin matrice Plus long que la séquence souhaitée

PCR Page 19 1er cycle:

PCR Page 19 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles

PCR 2ème cycle: Synthèse de brins complémentaires Page 19 2ème cycle: Synthèse de brins complémentaires Apparition des premiers brins avec la longueur souhaitée

PCR Page 19 2ème cycle:

PCR Page 20 Une réaction PCR = succession d’une trentaine de cycles

PCR 3ème cycle: Synthèse de brins complémentaires Page 19 3ème cycle: Synthèse de brins complémentaires Apparition des premiers amplicons Amplicons = ADN double-brins bornés par les amorces = fragments d’ADN recherché.

PCR Comment peut-on déterminer le nombre d’amplicons obtenu après un certain nombre de cycles? Nbre d’amplicons = 2n – 2n (n = nbre de cycles) = nombre de copies d’ADN = nombre de copies longues

PCR Réaction enzymatique complexe Amplification exponentielle tant que l’ADN matrice est le seul facteur limitant

PCR Durant la réaction: limite le nombre de copies à 105 - 106 ↓ quantité d’amorces et de dNTP ↑ nombre de copies d’ADN → ↑ viscosité du milieu → ↓ vitesse réactionnelle Synthèse d’ADN → libération d’ions phosphate → inhibition de la Taq polymérase. limite le nombre de copies à 105 - 106

PCR A la fin: Séparer les fragments d’ADN amplifiés → amplicons Electrophorèse (gel d’agarose) Comment ?

PCR Ses applications (très nombreuses): Page 20 Ses applications (très nombreuses): But principal = rendre décelable, et de ce fait analysable, de l’ADN, souvent présent à l’état de traces. La recherche d’une pathologie Le diagnostic anténatal ou prénatal La recherche de personnes (criminalistique)