III. Substrats sonde pour l’étude des mécanismes enzymatiques CP450 (suite)

CP450, mécanisme

Mécanisme concerté vs. 2 étapes Pas de transposition allylique et rétention de configuration >90%

Mécanisme concerté vs. 2 étapes

Mécanisme concerté vs. 2 étapes +

Horloges radicalaires

Horloges radicalaires Pas de transposition

Nitroxyl radical coupling K. U Ingold

Barton’s PTOC

Calibration d[R’]/dt = k1[U’] - k-1[R’] - k[R’][P] k1[U’]/k[R’][P] - k-1[R’]/k[R’][P] = 1 k1[U’]/k[R’][P] = 1 k1 = k[R’][P]/[U’] k1 = k[R][P]/[U]

Calibration

CP450, mécanisme radicalaire? d[U’]/dt = k[1] - kreb.[U’] - kR[U’] d[R’]/dt = kR[U’] - kreb.[R’] = 0 ; [U]/[R] = [U’]/[R’] kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = 2 109 x 7/1 = 1.4 1010 s-1

Horloges radicalaires Les rapides Les très rapides

Horloges radicalaires 1.4 1010<kOH< 7 1012

Pourquoi cet écart? Mécanisme mal modélisé 2) Calibration des horloges pas présise 3) Effet stérique et effet de la protéine sur le réarraangement kOH = 1013 s-1

Il faut remettre les pendules à l’heure 1.4 1010<kOH< 7 1012

Les horloges ne donnent pas la bonne heure!!!!! 1-2 1013 s-1 > à la vitesse de décomposition d’un état de transition Trop rapide pour l’existence d’un intermédiaire

Et M. Newcomb propose un mécanisme avec un C+

A la recherche d’une horloge à C+

A la recherche d’une horloge à C+

A la recherche d’une horloge à C+

Mécanisme avec un ion carbénium? 1 à 3%

M. Newcomb persiste et signe Si radical  temps de demie vie de 1.7 10-13 s (trop court pour un intermédiaire) Si radical  rapport B/C plus grand Conclusion : mécanisme avec insertion directe de « OH » avec réaction secondaire

0.6%

Nouveau mécanisme

Effet isotopique kH/kD

Effet isotopique kH/kD

2 1

CP450, deux oxydants possibles

CP450, deux oxydants possibles Insertion de « O » Hydroxylation Insertion de « OH » Responsable de la formation des produits transposés

CP450, deux oxydants possibles Insertion de « O » Hydroxylation Insertion de « OH » Responsable de la formation des produits transposés

Epoxydation des oléfines

Substrat-suicide

Vérification des hypothèses appel à la biologie moléculaire Mutant thréonine  Alanine (T303A)

Hydroxylation vs. epoxydation FeV=O FeIIIOOH Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450 P450 T303A

Hydroxylation vs. epoxydation FeV=O FeIIIOOH Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450 P450 T303A

Et avec les horloges? Hydroxylation

Hydroxylation des aromatiques, NIH shift

Hydroxylation des aromatiques, NIH shift

Et avec les horloges? Rapport R/U élevé Rapport R/U faible Hydroxylation Rapport R/U élevé Rapport R/U faible

Effet isotopique kH/kD

M. Newcomb, le retour Pas de radical!!!!!!!

Comment Shaik arrive à réconcilier tout le monde

Shaik serait-il normand?

Low Spin vs. High Spin • HS LS

Calculs DFT

Low Spin vs. High Spin

CP450, mécanisme radicalaire? fuite kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = 2 109 x [U]/[R]

Oxydation des amines

Oxydation des amines

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