Champignons toxinogènes et mycotoxicoses Patrick BOIRON Laboratoire de Mycologie, Faculté de Pharmacie, Lyon, France

Champignons induisant des manifestations cliniques chez l’homme Différences essentielles entre champignons Vénéneux (toxiques) : mycétismes Toxinogènes : mycotoxicoses Pathogènes stricts Opportunistes Allergènes : allergies fongiques mycoses

Champignons sur les denrées alimentaires Champignons « bénéfiques » : industries fromagères (Penicillium, Geotrichum) et viticoles (levures sauvages ou sélectionnées)

Champignons sur les denrées alimentaires La contamination initiale des denrées alimentaires non soumises à stérilisation ou pasteurisation, par des spores de moisissures est inévitable

Champignons sur les denrées alimentaires Champignons « indésirables » : moisissures (Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, etc.) banales ou toxiques (Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus, Penicillium expansum, etc.)

Champignons sur les denrées alimentaires Le développement des moisissures sur les denrées alimentaires peut conduire : A une dépréciation de leur valeur nutritionnelle et une altération de leurs caractères organoleptiques, A des risques pour le consommateur (animal ou homme) et le manipulateur : mycoses (Aspergillus fumigatus), allergies (foin moisi), mycotoxicoses

Mycotoxines Métabolites secondaires de faible poids moléculaire

Mycotoxines Fixées au niveau des spores ou excrétées dans le milieu contaminé (aliments, eau)  toxicité potentielle ou réelle pour les hommes et les animaux par : Inhalation Ingestion Plus rarement, par contact

Mycotoxines Mycotoxines inhalées partiellement solubles dans l’eau pulmonaire des alvéoles :  circulation générale  troubles généraux respiratoires et/ou spécifiques d’organes (milieux professionnels industriels et agricoles ; domestique ?)

Mycotoxines Les connaissances concernent surtout les mycotoxicoses par ingestion (population générale)

Conditions physico-chimiques de développement Disponibilité en eau Température Composition gazeuse Influence du substrat

Disponibilité en eau Germination conditionnée par l’activité en eau (aw) dans la spore Croissance du mycélium conditionnée par l’eau disponible dans le substrat Classification en : Xérophiles : Aspergillus restrictus, A. glaucus, A. versicolor Mésophiles : Aspergillus flavus, A. nidulans, A. fumigatus, Penicillium expansum, P. cyclopium Hygrophiles : Cladosporium, Fusarium, Mucorales

Température Conditionne la compétitivité Rôle prépondérant sur la croissance, le développement et la physiologie Eventail très large (optima : 20 – 25°C) Croissance / survie

Température Cladosporium herbarum : croît à – 6°C et survit à – 20°C Aspergillus flavus : survit à 35°C dans les tunnels de pâtes Aspergillus fumigatus tolère 55°C Byssochlamys germe après 10 min à 85°C Ascospores de Neurospora germent après 20 min à 130°C (four de boulangerie)

Température Classification en : Thermophiles : Byssochlamys, Aspergillus fumigatus, … Thermotolérants : Aspergillus niger, … Mésophiles : Penicillium chrysogenum, Aspergillus versicolor, … Cryophiles : Cladosporium, Alternaria, …

Composition gazeuse Moisisures aérobies Aérobies « tolérantes » Rôle limitant et sélectif du rapport O2 / CO2 Aptitude au confinement : Penicillium roqueforti Anaérobies rares : Byssochlamys nivea

Influence du substrat Rupture des défenses naturelles (graines, fruits, etc.) Résistance mécanique au tassement (volume d’air intergranulaire en stockage) Sélection naturelle des espèces cellulolytiques : Stachybotrys sur pailles Spécificité d’hôte : Penicillium expansum sur pommes A contrario : Penicillum roqueforti sur gélose !

Conditions biologiques de développement Intensité de la sporulation Longévité des spores Compétitivité entre espèces biologiques : Fongiques : Trichoderma viridae est presque exclusif Bactériennes : vitesse de croissance, pH, aw

Mycotoxicogénèse Grande diversité de familles chimiques (conséquence du métabolisme secondaire) Dérivés des acides aminés Alcaloïdes de l’ergot de seigle, acide aspergillique, gliotoxine, roquefortine, sporidesmines Voie des polyacétates Aflatoxines, acide pénicillinique, citrinine, fumonisines, ochratoxines, patuline, stérigmacystine, zéaralénone Dérivés des terpènes Diacétoxyscirpénol, déoxynivalénol, trichothécènes, verrucarines

Moisissure  ?  mycotoxine La présence – à un moment donné – d’une moisissure toxinogène est nécessaire pour qu’il y ait éventuellement production de mycotoxine La présence d’une moisissure – même toxinogène – n’implique pas obligatoirement la présence de mycotoxine L’absence de moisissure n’implique pas obligatoirement l’absence de mycotoxine

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Mycotoxines probables Blé, farine, pain, maïs, chips - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. citreoviride, P. cyclopium, P. martensii, P. patulum, P. pubertum - Fusarium moniliforme Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline Désoxynivalénol (DON) Zéaralénone Fumonisine Arachide, noix - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. expansum Trichothécènes Cytochalasines Acide cyclopiazonique

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Mycotoxines probables Tourte à la viande, viande cuite, fromage, cacao, houblon - Aspergillus flavus - Penicillium viridicatum, P. roqueforti, P. patulum, P. commune Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Patuline Viandes, porc salé, fromage - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium viridicatum, P. cyclopium Patuline, Pénitrem A Poivre noir et rouge, pâtes - Aspergillus flavus, A. ochraceus

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Mycotoxines probables Fèves, orge, maïs, sorgho, soja - Aspergillus flavus, A. ochraceus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. viridicatum, P. expansum, P. islandicum, P. urticae - Fusarium moniliforme - Alternaria Aflatoxines, Ochratoxine A Stérigmatocystine Acide pénicillique Citrinine Patuline Griséofulvine Alternariol Pâtisserie réfrigérée ou congelée - Aspergillus flavus, A. versicolor - Penicillium citrinum, P. cyclopium, P. viridicatum, P. martensii, P. citreoviride, P. urticae, P. palitans, puberulum, P. roqueforti Citrinine, Pénitrem A

Exemple de produits contaminés par des moississures toxinogènes Denrées Espèces toxiques contaminantes Mycotoxines probables Denrée alimentaire (stockage domestique) - Aspergillus - Penicillium - Fusarium oxysporum Aflatoxine, Ochratoxine A Acide kojique Patuline, Pénitrem A Acide pénicillique Trichothécènes Pomme et produits dérivés de pomme - Penicillium expansum Patuline

Moisissures et mycotoxines retrouvées dans divers aliments Champignon Toxines Denrées Aspergillus Aflatoxines, stérigmatocystine, ochratoxine A Maïs, arachides, graines de coton, graines de potiron, riz, haricot, tissus d’animaux (jambon, lard, saucisses, lait et dérivés Fusarium Trichothécènes (désoxynivalénol = DON, nivalénol = NIV, toxine T2, diacétoxyscirpénol = DAS), zéaralénone, fumonisine, fusarine, moniliformine Blé, maïs, orge, riz, seigle, avoine, noix Penicillium Patuline, citrinine, pénitrem A, acide cyclopiazonique, ochratoxine A Fruits et jus de fruits, blé, riz, fromage, noix Alternaria Alternariol, acide ténuazonique Fruits, légumes et produits dérivés de pommes et tomates Claviceps Alcaloïdes de l’ergot Blés et dérivés, seigle

Moisissures présentes dans les fourrages et produits en silo Espèce fongique Mycotoxine Aspergillus flavus, A. parasiticus Aspergillus ochraceus Aspergillus fumigatus Aspergillus versicolor Penicillium veridicatum, P. cyclopium Penicillium aurantogriseum Penicillium roqueforti Pithomyces chartarum Wallamia sebi Stachybotris atra Aflatoxines, acide cyclopiazonique Ochratoxine A Fumigaclavines, gliotoxine Stérigmatocystine Ochratoxine A, citrinine, acide cyclopiazonique Verrucosidine, viomelléine, xanthomégnine Fumiclavine, roquefortine, PR toxine Sporodesmine Walleminol A Satratoxines Espèce fongique Mycotoxine Fusarium culmorum, F. graminearum, F. sporotrichoides Fusarium moniliforme Claviceps Alternaria Acremonium lolii Acremonium coenophialum Phomopsis leptostromiformis Désoxynivalénol (DON), toxine T2, diacétoxyscirpénol (DAS), zéaralénone Fumonisine, moniliformine Ergotamine, ergostine, ergocrystine, acide lysergique Acide ténuazonique, alternariol Lolitrem, paxilline Ergopeptine Phomopsines

Expression des mycotoxicoses Cutanée Nerveuse Vasculo-sanguine Génitale Hépato-biliaire et rénale Ergotisme Eczéma facial des ruminants Dermatose des manipulateurs de céleri (Gangrène sèche de la fétuque) (Hyperkératose des bovins) Clavatoxicose Diplodia-toxicose Sialorrhée des ruminants Leuco-encéphalomalacie des équidés (Maladie des tremblements) Aleucie toxique alimentaire Fusariotoxicose Stachybotriotoxicose Maladie du mélilot âgé Zéaralénone toxicose Phyto-oestrogènes : coumestrol Aflatoxicose Ochratoxicose (± citrinine) (Néphropathie endémique des Balkans) Phomopsis-toxicose (lupinose)

Formes aiguës de mycotoxicoses chez les animaux domestiques Espèces fongiques Mycotoxines Espèces animales Syndrome primaire Fusariose Fusarium moniliforme Fumonisine B1 Porc Œdème pulmonaire Vomitoxicose Fusarium sporotrichoides Désoxynivalénol Entérite, vomissements T2 toxicose Fusarium Toxine T2 Porc, veau, volailles Nécrose dermique, gastroentérite DAS toxicose Diacétoxyscirpénol Nécrose du tube digestif, hémorragies Leucoencéphalomalacie Cheveau Incoordination des mouvements F2 toxicose Fusarium graminearum Zéaralénone Oestrogénisme

Formes aiguës de mycotoxicoses chez les animaux domestiques Espèces fongiques Mycotoxines Espèces animales Syndrome primaire Aflatoxicose Aspergillus spp. Aflatoxines Volailles, veau, porc, chien Hépatite, hémorragies, mort Ergotisme Claviceps Acide lysergique Veau, mouton, poulet Gangrène, crise nerveuse, baisse de la reproduction Eczéma facial Phitomyces Chartarum Sporidesmines Mouton, veau Photosensibilisation, cholangiome Ochratoxicose Aspergillus ochraceus Penicillium viridicatum Ochratoxine A Porc, dindons, volailles Néphropathie Stachybotryotoxicose Stachybotrys atra Satratoxine, verrucarine Chevaux Nécrose dermique, gastroentérite, dépression du système hématopoïétique Trémor Acremonium spp. Pénitrem A Veau, mouton, chien Ataxie, prostration Slaframine toxicose Slaframine Veau, mouton Salivation, diarrhée, polyurie

Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (aiguë) Symptômes Espèces fongiques Mycotoxines Substrats Pays Ergotisme gangréneux Vasoconstriction, gangrène Claviceps purpurea, C. fusiformis Alcaloïdes de l’ergot Seigle, céréales Ethiopie, Inde Aleucie toxique alimentaire (ATA) Brûlures digestives, nausées, vomissements Fusarium spp. Trichothécènes Céréales, pain Russie, Japon, Corée Maladie de Kaschim-Beck Arthrite osseuse Céréales Chine Onyalai Hémorragie du rhino-pharynx et tube digestif Phoma sorghina Acide ténuazonique Millet Afrique du Sud Béribéri cardiaque Anomalie cardiaque, mort par dépression respiratoire Penicillium Citréoviridine Riz Japon

Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (aiguë) Symptômes Espèces fongiques Mycotoxines Substrats Pays Kwashiorkor Dénutrition énergétique Aspergillus parasiticus Aflatoxines Céréales Kenya, Soudan (enfant) Syndrome de Reye Accumulation d’acides gras : foie, rein, cœur, encéphalopathie, œdème Thaïlande (enfant) Kodua Somnolence, perte d’équilibre, troubles nerveux Aspergillus flavus Acide cyclopiazonique Millet Inde Hépatite aiguë Jaunisse, œdème Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus Céréales (maïs) Inde, Afrique Dermatite Allergie cutanée Sclerotinia Psoralène Céleri

Implication de mycotoxines dans des épidémies chez l’homme Maladie (chronique) Symptômes Espèces fongiques Mycotoxines Substrats Pays Cancer de l’œsophage Tumeurs Fusarium spp. Fumonisine, fusarine C Céréales Afrique du Sud Cirrhose (enfant) Nécrose du foie Aspergillus spp. Aflatoxine Inde Hépato-carcinomes Tumeur du foie Afrique, Inde Néphropathie endémique Nécroses des tubules et glomérules Penicillium verrucosum Aspergillus ochraceus Ochratoxine A Ex-Yougoslavie, Bulgarie

Aflatoxines

Mycologie Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Penicillium verrucosum Aspergillus flavus Penicillium verrucosum Aspergillus parasiticus

Substrats Nombreux produits agricole (arachides, céréales, tourteaux d’arachides, cacahuètes, …) Incidence importante dans la nourriture animale et humaine en régions tropicales

Conditions de croissance des souches toxinogènes Températures : Minimale : 12 °C Maximale : 42 °C Optimale : 28 – 30 °C Humidité relative en eau : 80 % Infection au champ, mais surtout au stockage

Toxinogénèse La croissance des champignons toxinogènes et la production d’aflatoxines sont influencées par différents facteurs : Le type de substrat La teneur en humidité La température Les dommages éventuels du substrat L’humidité relative de l’environnement

Structures et propriétés physico-chimiques 1963 : Asao propose la structure chimique des aflatoxines : ce sont des flavocoumarines Stables à la chaleur (250 °C), au froid, à la lyophilisation Instables à la lumière et aux UV Hydrolysables en milieu alcalin Solubles dans les solvants peu polaires (méthanol)

Biosynthèse 1992 : Chang découvre le gène responsable de la biosynthèse des aflatoxines Le cluster (zone regroupant les gènes) des aflatoxines est situé sur un fragment de 7,5 kb d’un chromosome de 4,9 Mb La biosynthèse des aflatoxines est composée de 4 grandes étapes générant des intermédiaires issus de diverses réactions chimiques et enzymatiques sous le contrôle du cluster aflR

Métabolisme

Absorption Voie orale Voie respiratoire Leur lipophilie gouverne leur absorption par un phénomène de diffusion passive Maximale à un pH 5 et au niveau du jéjunum Voie respiratoire

Distribution Liaisons non covalentes avec l’albumine et l’hémoglobine Phénomène de diffusion pour pénétrer dans le cytoplasme Stockage dans l’organisme par liaisons covalentes avec molécules tissulaires Passage trans-placentaire

Métabolisation Pour être toxique ou mutagène, l’aflatoxine doit être métabolisée La métabolisation est principalement réalisée par l’intervention des cytochromes hépatiques : Epoxydation par l’intervention de cytochromes P450 hépatique et pulmonaire Hydroxylation O-déméthylation Epoxyde hydrolase ou glutathion-S-transférase Réduction en aflatoxicol par la NADPH réductase

Elimination Par voie biliaire Par voie urinaire Par voie lactée Représente 60 % de l’élimination totale Surtout des métabolites conjugués Parfois aflatoxine B1 sous forme libre Par voie urinaire Présence d’autres métabolites Servent de marqueurs dans les intoxications Par voie lactée Uniquement aflatoxine M1 Problèmes pour l’allaitement Problèmes pour les denrées à base de lait

Biotoxicologie

Action sur les synthèses cellulaires Action sur l’ADN L’aflatoxine B1 ou son époxyde peut s’intercaler au sein de l’ADN L’aflatoxine B1 se fixe plus fortement dans les zones transcrites Cette fixation dépend de la séquence nucléotidique et de la taille du fragment Le site préférentiel est au niveau de la guanine dans les séquences contenant des cytosines

Action sur les synthèses cellulaires Action sur l’ARN L’aflatoxine B1 a une grande affinité pour l’ARN nucléaire et cytoplasmique et elle en affecte le métabolisme par inhibition de l’activité de l’ARN-polymérase L’effet varie en fonction de la dose d’aflatoxine B1

Action sur les protéines La synthèse des protéines intra- et extracellulaires est réduite

Action sur les métabolismes Métabolisme des glucides Réduction du glycogène hépatique Interférence avec le métabolisme énergétique des cellules animales Inhibition de la consommation d’oxygène des tissus

Action sur les métabolismes Métabolisme des lipides Accumulation de lipides dans le foie Diminution des concentrations sériques du cholestérol, des triglycérides, des phospholipides Perturbation de la synthèse et le transport des lipides Perturbation de l’absorption et la dégradation des lipides

Immunotoxicité Effets immunosuppresseurs après ingestion (et inhalation) Prédisposition à une surinfection par diminution des défenses immunitaires

Malformations fœtales Tératogénicité Malformations fœtales

Prévention

Prévention : lutte contre la contamination Avant la récolte Utilisation de souches aspergillaires non aflatoxicogènes : Agent biocompétitif En plein essor Uniquement dans les pays industrialisés car coûteuse

Prévention : lutte contre la contamination Autres moyens Élimination des pieds desséchés Irrigation suffisante Sélection de variétés de culture

Prévention : lutte contre la contamination Lors de la récolte Le ramassage A maturation Manuel ou mécanique Le nettoyage et la séparation Début du traitement industriel (taux résiduel d’aflatoxines possible)

Prévention : lutte contre la contamination Le séchage Teneur en humidité < 9 % Souvent à l’air libre en Afrique Le stockage Dans des silos le plus souvent Atmosphère contrôlée (température, humidité, CO2, …)

Prévention : lutte contre la contamination Le triage Manuel Dans les pays sous développés Analyses macroscopiques et morphologiques Mécanique Sélection par pression – dépression Procédés Sortex, Zig-Zag, Wogan

Prévention : détoxification Les traitements physiques Inactivation thermique Inactivation totale à partir de 267 °C Diminution de la qualité et de la quantité des protéines Irradiation Rayon gamma, UV, micro-ondes Adsorption par les solvants Utilisation de boue, de charbon activé, …

Prévention : détoxification Les traitements chimiques Moins coûteux que les autres techniques Applicables sur les aliments, les concentrés, … Existence de deux sites d’ouverture entraînant l’inactivation de l’aflatoxine B1

Prévention : détoxification Les traitements chimiques Ammoniation : méthode de référence Bisulfites Chlore : effets mutagènes Ozone : peu d’information Hypochlorite de sodium : grande efficacité Peroxyde d’hydrogène (uniquement en milieu liquide basique) : modification de la qualité protéique (et donc de la valeur nutritive)

Prévention : détoxification La décontamination biologique Bioconversion : Mucor griseocyanus

Ochratoxine A

Mycologie Genre Aspergillus Aspergillus ochraceus Aspergillus niger Aspergillus carbonarius

Mycologie Aspergillus ochraceus Croissance : température optimale de 24 à 37 °C ; pH de 3 à 10 Sur milieux de Czapek : colonies granuleuses de couleur ocre, revers brun jaunâtre Température optimale donc adaptée aux zones de stockage

Mycologie Genre Penicillium Penicillium verrucosum ou Penicillium viridicatum Principal producteur d’ochratoxine A en climats tempérés (20 °C) Thalle velouté vert - bleu à vert - gris et revers orange-brun sur milieu CYA

Patuline

Mycologie La patuline est produites par des divers champignons appartenant aux genres : Penicillium : P. expansum, P. patulum, P. claviforme, … Aspergillus : A. clavatus, A. gigantus, A. terreus Paecilomyces variotii Byssochlamys : B. nivea, B. fulva INTERRESSONS NOUS MAINTENANT AUX ORIGINES DE LA PATULINE.

Penicillium expansum Principal responsable des contaminations Colonie verte terne, avec un mycélium blanc en marge et un exsudat orange brun caractéristique Champignon bi ou triverticillé, avec un conidiophore lisse, des métules et des phialides rassemblées en verticilles et des conidies elliptiques DONC REVENONS SUR PENICILLIUM EXPANSUM

Conclusion Connaissances scientifiques très insuffisantes : requièrent la collaboration de mycologues, médecins, pharmaciens, vétérinaires et toxicologues

Conclusion Principaux axes de recherche : Ecologie des champignons et conditions de sécrétion Moyens préventifs de lutte Méthodes chimiques et biologiques de détection rapide Détoxification sans dénaturation Recherche des mycotoxines comme causes possibles de maladies humaines mal connues