Transport placentaire et anomalies de la croissance fœtale

Rappels : macrosomie Augmentation de la croissance fœtale aboutissant à un bébé de mensurations supérieures à la normale pour le terme. Observée dans les grossesses dans un contexte de diabète. Complications : Accouchement difficile Malformations congénitales, détresse respiratoire néonatale Risque de développement de diabète et obésité à l’âge adulte (Pettitt et al. 1991, 1993) Mécanisme inconnu…

Rappels : transporteurs placentaires Transporteurs d’acides aminés Système A isoforme gène codant affinité particularités localisation SNAT 1 Slc38a1 Petits acides aminés neutres Co transport Na+ Membrane microvillositaire et membrane basale SNAT 2 Slc38a2 SNAT 4 Slc38a4 lysine, leucine Indépendant Na+

Rappels : transporteurs placentaires Facteurs régulant le système A: insuline, cortisol, oxygène, disponibilité des acides aminés, cytokines Activité diminuée dans les retards de croissance intra utérins

Rappels : transporteurs placentaires Système L Isoforme gène codant affinités particularités Localisation LAT 1 Slc7A5 acides aminés neutres Hétérodimère : chaines légère associées à une chaîne lourde (4F2hc ou CD98) Membrane micro villositaire et membrane basale LAT 2 Slc7A8 LAT3 Slc43A1 LAT4 Slc43A2

Rappels : transporteurs placentaires Transporteurs glucidiques: GLUT1 GLUT3 GLUT4

Le placenta : détecteur de nutriments?

Rappels : HbA1C Hémoglobine glycosylée (HbA1C) reflet du contrôle glycémique à long terme Facteur prédictif de macrosomie durant le 1er trimestre de grossesse. (Rey et al. 1999) Incidence de macrosomie élevée même si contrôle glycémique strict! (Evers et al. 2002) Rôle des hyperglycémies transitoires en début de grossesse dans la macrosomie?

Hypothèse: Modèle animal Des épisodes d’hyperglycémie transitoire en début de grossesse sont à l’origine de l’augmentation : de la croissance placentaire de la capacité de transport de nutriments du placenta au fœtus, entraînant une macrosomie Modèle animal

Matériel et méthode Rattes gestantes, hyperglycémies provoquées en début ou fin de gestation vs témoins Mesure, à terme : Des poids : placenta, fœtus, litière. Moyenne calculée par portée. Des expressions protéiques et RNA des transporteurs placentaires GLUT1, GLUT3, SNAT2, LAT1, LAT2. Comparaison par test de Student. P<0.05.

Expressions ARN et Protéines Matériel et Méthodes Groupe GD 7 GD 10 GD 11 GD 18 GD 19 GD 21 1 inj précoce n=5 - 1 x IP Poids à terme Expressions ARN et Protéines 3 inj précoces n=8-9 3 x IP/4h 6 inj précoces n=9-11 3 inj tardives n=7-8 IP : intra péritonéal 1 injection = 2g/kg de glucose Témoins : injections sérum physiologique; appariés par poids.

Résultats : poids Fœtus : Placenta : Litière : 3 inj précoces : +9% Pas de différence significative

Résultats : ratio poids fœtus/placenta

Résultats : expression protéiques des transporteurs placentaires Homogénats de placentas de rattes Western blot, GLUT1, GLUT2, SNAT2 Contrôle positif : membrane microvillositaire humaine (SNAT2 et GLUT1) Cerveau de rat (GLUT3)

Résultats : expression protéiques des transporteurs placentaires évaluation de la densité relative des bandes: Densité moyenne du groupe contrôle = 1 Densité moyenne du groupe hyperglycémique rapportée au contrôle

Résultats : expression protéiques des transporteurs placentaires Western blot

Résultats : expression protéiques des transporteurs placentaires A : 3 injections précoces B : 6 injections précoces Pas de différence significative

Résultats : expression ARNm des transporteurs placentaires PCR quantitative pour évaluation de l’expression ARNm à terme de GLUT1, GLUT3 SNAT2 LAT1, LAT2 Relative à un gène de ménage : SDHA

Résultats : expression ARNm des transporteurs placentaires Expression mRNA moyenne du groupe contrôle = 1 Expression mRNA moyenne du groupe hyperglycémique rapportée au contrôle

Résultats : expression ARNm des transporteurs placentaires A : 3 inj précoces Pas de différence significative B : 6 inj précoces Expression relative à SDHA

Expressions ARN et Protéines Matériel et Méthodes Groupe GD 7 GD 10 GD 11 GD 18 GD 19 GD 21 1 inj précoce n=5 - 1 x IP Poids à terme +/- Expressions ARN et Protéines 3 inj précoces n=8-9 3 x IP/4h 6 inj précoces n=9-11 3 inj tardives n=7-8 IP : intra péritonéal Témoins : injections sérum physiologique; appariés par poids.

Evaluation du transport placentaire in vivo Groupe GD 7 GD 10 GD 11 GD 18 GD 19 GD 21 3 inj précoces - 3 x IP/4h cathéter Transport in vivo 6 inj précoces

Transport placentaire in vivo à terme GD18 : cathéter chez groupes de rattes à 3 ou 6 injections précoces GD21 : Administration IV de 3-O-methyl-D-[3H]-glucose pour évaluation du transport glucidique. De [14C]methyl-aminobutirique acide (MeAIB), pour évaluation du transport d’acides aminés. Sacrifice 7min plus tard

Transport placentaire in vivo à terme Prélèvement Placenta Fœtus Homogénats placenta et foetus pour chaque portée

Transport placentaire in vivo à terme Mesure de la radioactivité avec un compteur à scintillation liquide: assimilation placentaire de l’isotope/g de placenta Transport placentaire (quantité isotope/g de fœtus) Capacité de transport relative du placenta (quantité d’isotope transportée/g de placenta) Comparaison vs témoins par test de student

Résultats : transport placentaires in vivo à terme Groupe 3 injections précoces Groupe 6 injections précoces

Résultats : glycémie et insulinémie maternelles Groupe 6 injections précoces vs contrôle GD21 Pas de différence significative pour glycémie et insulinémie

Discussion « Nouveauté »: Élévations transitoires de la glycémie en début de gestation chez la ratte suffisent à entrainer une augmentation de poids du fœtus Effet pouvant être expliqué par une augmentation de poids du placenta Ce n’est pas le cas pour les hyperglycémies tardives

Discussion Lien poids placenta/fœtus déjà démontré Grossesses normales (Kloosterman, 1970) Grossesses compliquées d’accélération ou de retard de croissance (Jansson et al. 1998, 2002)

Discussion Croissances placenta + fœtus peuvent être affectées par de brèves perturbations métaboliques chez la mère en début de grossesse Interêt pour la prise en charge des grossesses compliquées dans un contexte de diabète Fluctuations des glycémies maternelles à prendre en compte, pas seulement HbA1C

MAIS…

Discussion Hyperglycémies suivies d’une hyperinsulinémie chez le modèle Rôle de cette hyperinsulinémie dans l’augmentation des poids foetoplacentaires?? Modèle de rattes diabètiques…

Discussion MAIS... avant terme?? acides aminés autres?? Pas de différence significative dans l’expression protéique ou ARN ou transport in vivo Aucune preuve d’une stimulation des transports placentaires glucose et acides aminés due aux hyperglycémies transitoires à terme. Au contraire, diminution d’activité du système A. MAIS... avant terme?? acides aminés autres?? transport lipidiques??

Conclusion Des hyperglycémies transitoires précoces chez la ratte gestante stimulent la croissance fœtale. Augmentation du poids placentaire associé, probablement augmentation du transport placentaires. A terme pas de différence dans transport glucidique ou acides aminés du système A. Mécanisme métabolique?

Critiques… Nombre exact d’animaux peu clair… Placenta rat/humain comparables? Hyperglycémies provoquées chez rattes NON diabètiques Évaluation à terme : ponctuelle, « le mal est fait »… Compléter avec d’autres isoformes

Régulation du transport d’acides aminés par les cytokines IL6 : stimule l’assimilation hépatique d’acides aminés chez le rat (Watkins et al. J Trauma, 36:523-528, 1994) TNFα : stimule l’assimilation d’arginine des cellules endothéliales de veine ombilicale chez l’homme (Sala et al. AJP – Cell Physiol, 282:C134-C143, 2002) IL1β : inhibe l’activité du système A dans les lignées cellulaires de trophoblastes (Thongsong et al. J Soc Gynecol Investig, 12:495-503, 2005) Mécanismes de signalisation intra-cellulaires inconnus.

Rappels : grossesses compliquées et cytokines pro inflammatoires Dans les grossesses compliquées de diabète ou d’obésité, augmentation des taux maternels : d’interleukine 6 (IL6), corrélée avec l’adiposité fœtale de tumor necrosis factor (TNF) α (Catalano et al. 2006; Radaelli et al. 2006; Challier et al. 2008) Croissance fœtale anormale Rôle des cytokines dans la régulation des transporteurs placentaires?

Hypothèse Les cytokines pro inflammatoires IL6 et TNFα stimulent l’activité des transporteurs placentaires d’acides aminés MACROSOMIE

Matériel et méthodes : les cellules Placenta humains normaux, à terme Dispersion des cellules par Trypsine DNAse Gradient de Percoll Isolement de cellules cytotrophoblastiques Contrôle de la pureté par anticorps anti vimentine Klidman et al. 1986

Matériel et Méthodes : les cellules Mise en culture 90h Changement de milieu à H20, 44 et 66 pour obtention de cellules trophoblastiques primaires. Incubation avec cytokines (IL6 ou TNFα) pendant 24h.

Matériel et Méthodes : Analyse de l’assimilation des acides aminés Système A : mesure de l’assimilation d’acide 2-(methylamino)- isobutyrique marqué au 14C (MeAIB), Na+ dépendante . Système L : mesure de l’assimilation de L-[3H]leucine, inhibable par l’acide 2-aminobicyclo(2.2.1)heptane- 2carboxylique (BCH) RM ANOVA; p<0.05

Résultats : activité système A en présence IL6 ou TNFa Après 24h d’incubation: IL6: augmente l’assimilation à des doses physiologiques seulement. TNFa: augmentation de l’assimilation de MeAIB dose- dépendante ** : P<0.01 * : P<0.05 6 placentas

Résultats : activité système L en présence IL6 ou TNFa Assimilation de 3HLeucine inchangée quelques soient les taux d’IL6 et TNFa ** : P<0.01 * : P<0.05 6 placentas

Résultats : IL6 et TNFa n’ont pas d’influence, quelques soient leurs concentrations, sur l’assimilation de 3HLeucine, représentative du système L. IL6 et TNFa augmentent, à des doses physiologiques, l’assimilation de MeAIB, représentative de l’activité du système A.

Augmentation de l’activité du système A par TNFα et IL6 : mécanisme?

Analyse par PCR de l’expression ARN des isoformes du système A dans la lignée de cellules trophoblastiques primaires exposées à IL6 ou TNFα ou témoin RM ANOVA ** : P<0.01 * : P<0.05 7 placentas

Etude par western blot de l’expression protéique des isoformes du système A dans la lignée de cellules trophoblastiques primaires exposées à IL6 ou TNFα ou témoin RM ANOVA ** : P<0.01 * : P<0.05 7 placentas

Influence d’IL6 et TNFα sur l’activité du système A Augmentation de l’expression ARN et protéine de SNAT2 après exposition à l’IL6 ou TNFα à des doses physiologiques. Augmentation de l’expression protéique de SNAT1 après exposition à l’IL6 ou TNFα à des doses physiologiques. Pas de changement de l’expression ARN de SNAT1 après exposition à l’IL6 ou TNFα à des doses physiologiques. Quelle est la voie de signalisation impliquée?

Voie de signalisation JAK/STAT Voie intracellulaire « clé » pour médier les effets de l’IL6 sur la transcription. activation transcriptionnelle par phosphorylation des STAT (Signal transducer and activator of transcription 3) Rôle de STAT3 dans l’augmentation de l’expression ARN de SNAT2? web.nchu.edu.tw

Implication de STAT3 dans l’augmentation d’expression ARN de SNAT2? Analyse du taux de phospho-STAT3 après exposition des cellules trophoblastiques primaires à IL6 ou TNFα. Effet d’un knock down de STAT3?

Analyse du taux de phospho-STAT3 après exposition IL6 ou TNFα : western blot

Knock down de STAT3 : ARN-interferences Culture des cellules trophoblastiques primaires pendant 20h Mise en présence d’agents lipidiques transportant des siRNA anti STAT3 ou « brouillés » pendant 24h IL6 ou TNFα pendant 24h

Knock down de STAT3 : ARN-interferences

Knock Down de STAT3 par ARN interferences : expression ARN 4 placentas P<0.05

Knock Down de STAT3 par ARN interferences : expression protéique SOCS3 (suppressor of cytokine signaling 3): cible d’IL6-STAT3 Diminution de l’expression protéique de STAT3, SNAT2 et SOCS3. 6 placentas **P<0.01

Knock Down de STAT3 par ARN interferences : effet sur phospho-STAT3 STAT3 siRNA : pas d’augmentation de l’expression de phosphoSTAT3 malgré stimulation par l’IL6. **P<0.05

Knock Down de STAT3 par ARN interferences : effet sur le transport d’acide amines par le système A STAT3 siRNA : Disparition de l’effet activateur de l’IL6 Persistance de l’effet activateur de TNFα. **P<0.01

Conclusions et Discussion Augmentation de l’activité du système A (transport d’acides aminés) en présence de concentrations « physiologiques » d’IL6 et TNFα dans la lignée de cellules trophoblastiques primaires humaines. Concentrations correspondant aux taux observés chez les femmes enceintes obèses ou diabètiques.

Discussion : effets IL6 Mécanisme? L’exposition à IL6 entraine une augmentation de l’expression ARN et protéique de SNAT2, dépendante de la voie de signalisation STAT3, probablement par augmentation de la transcription. Une augmentation de l’expression protéique de SNAT1, sans effets de STAT3 siRNA, régulation probablement post-transcriptionnelle. Mécanisme?

Discussion : effet IL6 Stimulation par IL6 à des doses « physiologiques » mais pas au-delà : probablement dû à autorégulation par SOCS3.

Discussion L’exposition à TNFα entraine une augmentation de l’expression de l’isoforme SNAT2 non dépendante de STAT3. Autres voies à explorer : Voie NF-κB et mTOR? (mammalian target of rapamycin; activateur du système A transporteur d’acides aminés – Roos et al. Am J Cell Physiology 296: C142- C150, 2009) ERK Recepteur cellulaire à TNFα ?

Discussion Identification d’un lien moléculaire entre cytokines proinflammatoires et transport placentaire d’acides aminés. Implication de STAT3 mise en évidence pour la première fois. Différence de régulation des différents isoformes (SNAT1, -2, -4) déjà rapportée, probablement par des voies intracellulaires distinctes.

Discussion Maintien de l’activité basale du système A malgré siRNA anti STAT3: Rôle de SNAT1? Redistribution de SNAT2 des compartiments intra cellulaires à la membrane?

Discussion : Lien entre inflammation et insulino résistance Les taux élevés d’IL6 et TNFα chez les femmes enceintes obèses ou diabètiques peuvent jouer un rôle dans l’augmentation de l’activité du système A transporteur d’acides aminés, entrainant ainsi un trouble de la croissance fœtale. IL6 et TNFα sont un lien entre l’inflammation et l’insulino-résistance (Dandona et al. Trends Immunol. 25: 4-7 2004). Le mécanisme exact reste à établir.

Discussion mTOR a pour cible kinase S6K1, entraîne une insulinorésistance. Or, la voie de signalisation mTOR est activée par les acides aminés (Roos et al. Am J Cell Physiology 296: C142-C150, 2009). L’augmentation de l’assimilation d’acides aminés pourrait ainsi entraîner une insulino résistance. La stimulation de l’assimilation cellulaire d’acides aminés par des cytokines proinflammatoires pourrait être le lien entre inflammation et insulino résistance.

Conclusion Il existe des liens, probablement variés, entre troubles de la croissance fœtale et modifications du transport placentaire de nutriments. Influences des pathologies maternelles fréquentes : diabète, obésité Interêt clair à les éclaircir, meilleure prise en charge médicale des patientes