Community Proteomics of a Natural Microbial Biofilm Rachna J. Ram et al.

Contexte Les communautés microbiennes jouent un rôle clé dans les cycles biogéochimiques globaux Connaissances sur la structure et sur les activités métaboliques des communautés sont limitées Les cultures pures ne permettent pas d’étudier les interactions entre microorganismes Les drainages miniers acides (AMD) sont une source de pollution pour les milieux aquatiques: Ils libèrent des composés métalliques toxiques et acidifient les systèmes hydrographiques facteurs de production de ces AMD étudiés

Spectrométrie de masse « shotgun » Objectifs Analyse de l’activité microbienne d’un biofilm naturel peu complexe issue des drainages miniers acides ANALYSE GENOMIQUE ETUDE PROTEOMIQUE Spectrométrie de masse « shotgun »

Zone d’ étude Californie (USA) Richmond mine (Iron Mountain) Biofilm de AMD (Drainages miniers Acides)

Caractéristiques Echantillon Biofilm bactérien : Croissance en milieux : acides (pH ~ 0,8), thermophiles ( ~ 42°C), riche en Fer ([Fe] ~ 1M), et [Cu ; As ; Zn ] ~ 1mM Pellicule mince et homogène (allure d’une feuille)

Caractéristiques Echantillon FISH : détermination de l’abondance des différentes communautés du biofilm Dominance de Leptospirillum group II (+ autres groupes de Leptospirillum, Sulfobacillus spp., Archaeas,….)

Analyse « Protéogénomique » Données génomiques  création d’une base de données de 12148 protéines (Biofilm dbl) Sur différentes fractions du biofilms : Gel électrophorèse Nano-liquide + Spectrométrie de masse en tandem Nano-chromatographie liquide Switchos-Ultimate II

Résultats : étude protéique 1 ou plusieurs peptides assignés à 5994 protéines ( correspond à 49% des protéines codées par les génomes de 5 organismes les plus abondants) Elimination faux positifs  2033 protéines 1362 : Groupe Leptospirillum II 270 : Groupe Leptospirillum III 122 : « G-plasma » 99 : Ferroplasma type II 84 : Ferroplasma type I 30 : Archaeas Leptospirillum II  48% des protéines de la base de donnée :  Diversité physiologique et structurelle du biofilm

Résultats : étude protéique Abondance relative des protéines : Beaucoup de nouvelles protéines par rapport aux prédictions de la base de donnée (42%) Parmi les protéines abondantes : 15% sont uniques (pas de similarités significatives avec protéines connues) 2% sont conservées (prédites mais non caractérisées) 13% de protéines ribosomales 11% Chaperonnes 9% Thioredoxines 8% Protéines de protection aux radicaux libres + disulfides isomérases, péroxiredoxine , catalase, rubrerythrine Protéines connues Adaptations à l’environnement extrême

Résultats : Protéines extracellulaires Fraction extracellulaire enrichi en : Protéine unique (52%) Protéine conservé (14%) Présomption de fonctions importantes dans la solution des AMD (métabolismes oxydatifs et fonctions de résistances) Forte similarité (67%) d’une protéine : cytochrome de type c

Résultats : cytochrome 579 Recouvrement consensus et construction de la séquence de la protéine cyt579

Résultats : cytochrome 579 SM Pic unique à 579 nm Dans périplasme de Leptospirillum ferriphilum, puis exporté en dehors de la membrane (Clivage en N term d’une partie importante : Hème Binding) Cytochrome 579 catalyse les réactions suivantes : Oxydation du Fer Ferrique en Fer Ferreux (ou en Hydroxyde de fer) Oxydation du Fer et du soufre de la pyrite Pot. Réd. Cyt579 = +670mV (Transfert d’é si donneur é PR > +660mV) Enzymes clé  lie biologie et géochimie

Résultats : Catégories fonctionnelles de protéines Protéines le plus représentées dans le protéome : Métabolisme aminoacide Translation Protéines de repliement Métabolismes et transport des nucléotides

Résultats : Intéractions et physiologies dans le biofilm

CONCLUSION Approche « protéogénomique » a permis : d’appréhender la formation des AMD par les communautés microbiennes de découvrir les activités physiologiques au sein d’un biofilm issue d’un environnement extrême (adaptation à l’acidité, au métaux toxiques et aux espèces réactives de l’oxygène) de démontrer la présence d’interactions fines entre les différents microorganismes du biofilm (notamment sur la formation de polymères et la fixation de nitrogène)