Bactériologie et Médecine d’Urgence Chantal Roure Sylvestre Tigaud Laboratoire de Bactériologie Hôpital de la Croix-Rousse

Un Facteur Limitant : Le Temps Patient Examen Clinique Hypothèse Diagnostique Antibiothérapie Probabiliste Prélèvements 48 heures Evolution Clinique Antibiogramme

Objectifs des analyses microbiologiques Isoler, identifier les micro-organismes pathogènes et étudier leur sensibilité aux ATB Assurer la viabilité des bactéries potentiellement pathogènes dans les échantillons Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA) Maitrise des phases pré-analytiques, analytiques et de validation

Phase pré-analytique Prescription médicale Traçabilité : Fiche de liaison Identité patient, prescripteur,préleveur Renseignements utiles à la qualité de l’analyse Execution du prélèvement Le site du prélèvement Méthodes de prélèvement Modalités de transport et de conservation Sécurité

les deux types d’examens Diagnostic direct : mise en évidence du germe. Microscopie Culture Immuno-diagnostic Amplification génique. Sérodiagnostic (élévation des anticorps)

Diagnostic indirect Pour toutes les sérologies Intérêt : Préciser ce que l’on cherche, et pourquoi, Prélever sur un tube sec, Prévoir un deuxième tube à 10-15 jours d’intervalle à envoyer au même laboratoire Intérêt : Brucellose en phase subaigüe ou chronique Rickettsiose, Coxiellose, Legionellose, Leptospirose, Lyme

Examen Cytologique Riche d'information si et seulement si : Prélèvement normalement stérile (LCR) Morphologie des germes caractéristique (Pus à Staphylocoque, Gonocoque, Méningocoque) Modification caractéristique d'une flore conplexe (Gardnerellose, Cholera) Impossible sur les Hémocultures (facteur de dilution) L'examen microscopique n'intervient qu'après un temps de culture.

Dénombrement microbien Standardisé, simplifié et reproductible lorsque les germes sont en phase liquide homogène : cas des prélèvements urinaires. Dans les autres cas: dénombrement peu informatif fonction procédure d'homogénéisation et qualité du prélèvement...

Cultures bactériennes Il est illusoire d'imaginer que le bactériologiste va cultiver tous les germes possibles et imaginables L'ensemble des procédures ont été sélectionnées pour diagnostiquer les germes pathogènes les plus probables. Ne jouez pas à cache-cache avec votre bactériologiste ! Si vous avez des arguments d'orientation, dites-les !

Identification-Antibiogramme L'identification repose sur un ensemble d'arguments: Au fur et à mesure que le temps passe, nous précisons l'identification. L'antibiogramme est devenu un ensemble technique et conceptuel global, permettant de porter un diagnostic sur le phénotype de sensibilité. C'est le concept d'INTERPRETATION de l'antibiogramme, qui impose le choix d'antibiotiques testés DISCRIMINANTS

Hémocultures (1) Efficacité Prélèvement princeps de la Bactériologie. Quand prélever ? Avant Antibiothérapie, ou au cours d'une fenêtre, ou le plus loin possible de l'injection ou n'importe quand... Efficacité

Hémocultures (2) Réaliser un prélèvement de qualité Eviter les contaminants: antisepsie de la peau et désinfection du capuchon du flacon d’hémoculture Prélever une quantité de sang suffisante: densité bactérienne souvent faible <1 UFC/ml un volume de 20 ml de sang prélevé augmente le pourcentage de positivité de 30% comparativement à un volume de 10 ml Effectuer le nombre de prélèvement nécéssaire: bactérièmie souvent transitoire ou intermittente 30 à 60 min entre 2 prélèvements : 6 flacons/24H

Hémocultures (3) Choisir des conditions de culture appropriées Aérobiose-anaérobiose Dilution du sang: dilution optimale 1/10, chez l’enfant un prélèvement de 1 à 2 ml est satisfaisant, les flacons pédiatriques ont peu d’intérêt Anticoagulant SPS: inhibe l’activité bactéricide du sérum, la phagocytose, inactive le complément et neutralise les aminosides Neutralisation des antibiotiques: résines adsorbeuses de cations ou charbon activé indication: contrôle de l ’EI fébrile sous traitement

Hémocultures (4) Détecter précocément la croissance bactérienne Durée d’incubation suffisante : 7 jours à 35°C Méthodes automatisées +++ Méthodes manuelles Examen macroscopique quotidien des flacons Centifugation-lyse: système Isalator: lyse cellulaire et concentration des micro-organismes puis encemencement sur milieux adaptés Intéret : Mycobactéries, levures et champignons filamenteux Bactéries exigentes: HACEK, Bartonella, Legionella Prélèvements médullaire des brucelloses

Hémocultures (5) Il faut signaler : Les germes dangereux : Brucellose, Typhoïde, Francisellose Les germes à croissance difficile : Brucellose, Actinomycose Les germes quiescents : Endocardite Infectieuse, HACEK Les Levures Les prises d'antibiotiques Il faut utiliser des dispositifs spéciaux : Pour les Mycobactéries Pour les Chlamydia, Rickettsies, Bartonella

Prélèvements Pulmonaires Préciser les recherches spécifiques Mycobactéries, Legionelles,Aspergillus) Acheminer sans délai pour éviter la prolifération de la flore commensale Crachat : Intéret dans les Pneumopathies communautaires à condition que la contamination salivaire soit minimale Intéret de l'examen direct LBA et Brossage : plus informatifs

Urines (1) Examen cyto-bactériologique Recherche d’antigène spécifique : délai 30 min Legionella pneumophila 1 Streptococcus pneumoniae

Urines (2) Schéma de réalisation J0 Cytologie Ensemencement: anse calibrée Leucocyturie Germes Dénombrement Observation des cultures J1 Identification Antibiogramme J2

Urines (3) Recueil des urines et acheminement cas général habituel: « milieu du jet » après toilette cas particulier: recherche de mycobactéries sur la totalité de la 1ère miction du matin après restriction hydrique, 3 jours de suite suspicion d’infection urétérale ou prostatique: recherche de Chlamydia trachomatis ou de Mycoplasma sur urines du 1er jet Contenant poudrier stérile système de transport type Monovette

Urines (4) Interprétation Depuis les travaux de KASS: bactériurie <10*3 UFC/ml: absence d’infection bactériurie > 10*5 UFC/ml: infection probable entre 10*3 et 10*4 UFC/ml: zone d’incertitude Ces critères doivent être interprétés en fonction des données de l ’examen direct du caractère mon ou pluri-microbien des cultures des renseignements cliniques Place des bandelettes urinaires bon pouvoir prédictif négatif

Prélèvements de Pus et Liquides purulents Souvent très informatifs, Le prélèvement doit permettre une cytologie, la survie des germes fragiles, en particulier anaérobies. Ecouvillonage superficiel : intéret médiocre Chaque fois que possible, utiliser des dispositifs de survie des germes non prolifératifs (par exemple, Portagerm®).

Plaies, écoulement purulent Contexte suppurations primitives: anthrax, furoncles plaies traumatiques: habituellement surinfectées par des bactéries pyogènes morsures plaies contaminées par la terre ou l ’eau brulures Mode de prélèvement aspirer le pus dans une seringue puis aspirer 1 ml d ’eau physiologique stérile A défaut utiliser des écouvillons

LCR Acheminer le prélèvement sans délai Donner une orientation étiologique rapide examen macroscopique, cytologique et biochimique examen après coloration de Gram : positif dans 60 à 90% des cas en absence d’antibiothérapie préalable intérêt relatif de la recherche des Antigènes solubles (pneumocoque, méningocoque A, B, C, Haemophilus b) Ensemencer d’urgence les milieux de culture Interpréter les résultats des cultures méningite communautaire/décapitée

Les prélèvements Génitaux (1) Renseignements clinico-épidémiologique Qualité du prélèvement et du transport !!! ( M.S.T. donc germes fragiles) Suivre les recommandations du laboratoire local pour les recherches spécifiques (Mycoplasmes, Chlamydia) Prendre contact avec le bactériologiste pour les germes exceptionnels (Hemophilus ducreyi par ex.)

Les prélèvements Génitaux (2) Examen extemporané au microscope au fond noir de Treponema pallidum à partir de la sérosité d’un chancre Recherche à l’état frais de Trichomonas vaginalis Après coloration de Gram: diplocoques Gram négatif évoquant un gonocoque déséquilibre de la flore commensale, présence de « clue-cells » dans les vaginoses bactériennes Techniques d’amplification génique en routine Chlamydia trachomatis (Prélèvement vaginal, urétral ou d’urine), N. gonorrhoeae

Les Amplifications Géniques Techniques à n’utiliser qu’en collaboration transparente avec le biologiste. Coût prohibitif des techniques. Sensibilité réelle souvent inférieure à la sensibilité théorique. Il faut au minimum savoir ce que l’on cherche...

Prélèvement de gorge (1) Contexte Angines à Streptococcus pyogenes sensibilité de la culture (90-95%) contre 80-90% pour les trousses de détection rapide Autres contextes: angine ulcéro-nécrotique : recherche de l’association fusospirochétienne angine à fausse membrane : isolement de C. diphteriae candidose oro-pharyngée : recherche de C. albicans bilan initial de MST: isolement de N. gonorrhoeae

Prélèvement de gorge (2) Contexte Aucun intérêt dans : le phlegmon de l’amygdale (collection fermée) l’épiglottite principalement due à Haemophilus influenzae le syndrome angine-infarctus pulmonaire de Lemierre (du à Fusobactérium necrophorum) les ulcérations oro-pharyngées : Treponema pallidum difficile à distinguer des tréponèmes commensaux

Stratégie de la coproculture (1) Contexte plusieurs contextes épidémiologiques peuvent être identifiés en France métropolitaine les renseignements cliniques sont essentiels. Conservation à 4°C Diarrhées à germes invasifs/ Diarrhées à germes entérotoxigéniques (examen direct)

Stratégie de la coproculture (2) Coproculture standard adulte, enfant de plus de 2 ans, pas de contexte particulier rechercher Salmonella, Shigella, Campylobacter chez l’enfant, chez l’adulte sur demande ou si selle liquidc Yersinia enfants diarrhéiques sur demande, tableau d’adénite mésentérique

Stratégie de la coproculture (3) Cas particuliers (sur prescription) Enfant avant deux ans : +/- recherche d’Escherichia coli entéropathogènes (NB: origine virale fréquente) Voyage en pays tropical : ajouter V.cholerae Diarrhée séro-sanglante de type toxinique: Aeromonas et Pleisiomonas: absorption d’eaux polluées ou d’aliments contaminés (zone tempérée ou tropicale) Diarrhée post-antibiotique : ajouter C.difflcile SHU : ajouter la recherche des Escherichia coli entéro-hémorragiques producteurs de vérotoxine Epidémiologie (TIAC , portage de BMR)

Bioterrorisme Les principaux candidats: Bacillus anthracis Yersinia pestis Francisella tularensis Brucella Agents des fièvres hémorragiques Monkey Pox Toxine botulique

Bioterrorisme Diagnostic microbiologique Prélèvements de sources potentielles de contamination prise en charge au CRSSA Prélèvements cliniques prise en charge par les laboratoires hospitaliers méthodologie standardisée: hôpitaux référents choix de la technique: culture/biologie moléculaire interprétation sujet contact d’une action bioterroriste: quel est le rendement d’un prélèvement ? (ex écouvillonnage nasal/ charbon)