Leila Talby1, Sonia Meconi1, Laurent Samson1, Frederique Gouriet2, Claude Escarguel1, Michel Delaage 1. INODIAG 52 avenue de la tramontane ZI Athelia IV la Ciotat Unité des Rickettsies, CNRS UMR 6020, IFR 48, Faculté de Médecine, Université de la Méditerranée, 27 Boulevard Jean Moulin, Marseille cedex 05, France Mots clefs: Sérodiagnostic, Immunofluorescence indirecte, Multiplexage, Maladies sexuellement transmissibles, Tréponèma pallidum, Chlamydia Trachomatis Performances du test InoMust MST moins de 5  l de sérumautomatisé en moins d’une heure La société Inodiag a développé un test de diagnostic sérologique innovant nécessitant moins de 5  l de sérum. Ce test entièrement automatisé permet en une seule étape et en moins d’une heure la détection simultanée d’anticorps dirigés contre trois pathogènes, Chlamydia Trachomatis (CT), Tréponèma pallidum (P17) et Cardiolipides (C). La «puce à antigènes», un futur outil de sérodiagnostic des maladies sexuellement transmissibles Détection de cas de coinfections Tableau I: Caractéristiques sérologiques des sérums testés sur les lames InoMUST MST Inodiag Antigènes Techniques comparatives et seuilsNb de sérums P17 PositifTPPA (>80)62 NégatifTPPA (<80)86 Cariolipide PositifVDRL (> 8)16 NégatifVDRL (< 8)66 Chlamydia Trachomatis Positif ELISA > 0,4717 Négatif ELISA < 0,4744 InoDiag - Zone Industrielle Athélia IV avenue de la tramontane La Ciotat Cedex Téléphone : Fax : RICAI 2006 Tableau IV: Concordance (%) des résultats diagnostiques du test InoMUST MST et des tests de références. TestsTechniques comparativesConcordance* InoMUST Inodiag P17 (IgG)TPPA (Serodia Fujirebio)85 CariolipideVDRL (ServiBio)88 CT (IgG)ELISA (Sayon Diagnostic )85 Tableau III: Sensibilité*, spécificité ±, VPP ¥, VPN Ŧ (%) du test InoMUST MST et des tests de références AntigènesTechniques SensibilitéSpécificitéVPPVPN P17 InoMUST (Inodiag)72,694,29082,7 TPPA (Serodia)99, Cariolipide InoMUST (Inodiag)759166,6793,8 VDRLn (ServiBio) 100 CT InoMUST (Inodiag)82,486,47092,7 ELISA (Sayon)84,798,698,486,3 SE + = Syphilis évolutive positive, CT+ = Chlamydia Trachomatis positive, NC= Non connu Actuellement les tests de diagnostic sérologique permettent la détection d’une seule infection à la fois. Or, il est souvent nécessaire d’effectuer un bilan infectieux plus détaillé, c’est notamment le cas des MST, pathologies difficiles à diagnostiquer car souvent asymptomatiques. La multiplicité des tests devient très vite longue à réaliser et coûteuse. Applications Innovation et points forts Principe de base Les cut-offs classent les patients en trois groupes de risques infectieux faibles, intermédiaires et forts. Le 1er cut-off a une sensibilité proche de 100 % et une très bonne valeur prédictive négative. Le 3ème cut-off présente une valeur prédictive positive proche de 100 %. Enfin, le 2ème cut-off intermédiaire délimite une zone grise correspondant à une bonne sensibilité et une bonne spécificité. Ces cut-off définissent 4 groupes de sérums: les négatifs, les faiblement positifs, les positifs et les très positifs. Pour (P17) et (CT), seules les cut-off en IgG ont été établis. Par contre pour l’antigène (C) des cut-off en IgG et en IgM ont été déterminés. * La sensibilité est égale à la somme des vrais positifs (VP) divisée par la somme des vrais positifs (VP) et des faux négatifs (FN) : [Se= VP/(VP+FN) ]. ± La spécificité correspond aux vrais négatifs (VN) divisés par la somme des vrais négatifs (VN) et des faux positifs (FP) : [Sp = VN/(VN+FP)]. ¥ La VPP se calcule comme suit : [VPP= VP/(VP+FP) ]. Elle indique la probabilité qu’un patient avec un test positif soit infecté par le pathogène testé. Ŧ La VPN se calcule comme suit : [VPN= VN/(VN+FN) ]. Elle indique la probabilité qu’un patient avec un test négatif ne soit pas infecté par le pathogène testé. Réalisation de l’étude (Arrayer) Différents antigènes bactériens, virales ou parasitaires peuvent être déposés à l’aide d’un robot (Arrayer) sur des lames de verre. Des réseaux (biopuces) de plus de 36 antigènes peuvent ainsi être réalisés sur les lames InoMust de la société Inodiag. (Incubateur InoStainer) L’Incubation en parallèle de 4 biopuces peut être réalisée (Incubateur InoStainer). (Lecteur InoScan) La détection d’un spot fluorescent (Lecteur InoScan) sur la biopuce révèle une séropositivité du sérum vis-à-vis de l’antigène testé. (logiciel Inosoft). unités arbitraires de fluorescence (UA). L’Analyse des résultats est réalisée en moins d’une minute (logiciel Inosoft). La concentration des anticorps contenus dans l'échantillon de sérum est exprimée en unités arbitraires de fluorescence (UA). Enfin une fiche de résultats (de séropositivité ou de séronégativité) est obtenue. Procédés technologiques lames InoMust MST 3 antigènes 4 contrôles internes Dans le cadre de ce travail nous avons utilisé des lames InoMust MST pour déterminer le statut sérologique de sérums provenant du service de Bactériologie-Virologie de l'Hôpital la Timone de Marseille. Ces sérums ont été sélectionnés sur la base de leur séropositivité ou séronégativité aux tests de références (Table I). Les lames InoMust MST regroupent 3 antigènes, Chlamydia Trachomatis (CT), Tréponèma pallidum (P17), Cardiolipides (C) ainsi que 4 contrôles internes permettant la détection de signaux faux positifs tels que la présence de facteurs rhumatoïdes ou d’anticorps anti-ADN et/ou faux négatifs comme l’absence de sérum ou une hypoglobulinémie. Table II: Cut off des lames InoMUST MST Inodiag P17CardiolipideCT Zone 470 N (IgG) Inodiag 594 N (IgM) Inodiag 470 N (IgG) InodiagRésultat 1< 1800< 1500< 1000< /- 3> 2000> 2800> 2000> > 10000> 4000> 5000> Table V: Cas de coinfections détectés avec la lame InoMust Inodiag Techniques de référencesTechnique Inodiag Diagnostic P17CardiolipidesCTP17CardiolipidesCT (IgG) TPPA VDRL (IgG) CT (IgG) 470 N (IgM) 594 N (IgG) 470 N Seuil de positivité* > 80 > RéférentInodiag NC SE +SE+/CT NC SE +SE+/CT NC SE +SE+/CT NC SE +SE+/CT NC SE +SE+/CT+ Le Test sérologique InoMust MST développé par la société Inodiag permet en une seule étape, la détection quantitative des anticorps spécifiques des antigènes P17, cardiolipide et CT. Ce test offre tout les avantages d’un test multiplexé automatisé, facile à utiliser, rapide d’exécution et donnant des résultats quantitatifs précis. De plus il permet de détecter les cas de coinfections. Ce test est donc particulièrement indiqué pour le dépistage des populations à haut risque et pour la réalisation d’études épidémiologiques. Des études préliminaires nous ont permis de déterminer 3 cut-off. Ces cut-off définissent 4 groupes de sérums négatifs, faiblement positifs, positifs et très positifs. (Table II, figure 3 et 4 ). 365 nM (UV) Sérum humain Ac anti IgG ou IgM humain fluorescent 470 nM (FITC)594 nM (Texas Red) Diagnostic sérologique du Patient Lecteur InoScan® dépôt antigène (Spot) P17 Cardiolipide Détection des dépôtsDétection des IgGDétection des IgM Control IgG Control IgM Le test InoMUST MST permet la détection de cas de coinfections par les pathogènes Chlamydia trachomatis et Tréponème pallidum (Figue5, tableV). * La concordance est égale au ratio de la somme des vrais positifs (VP) et des vrais négatifs (VN) détectés par la technique InoMust divisés par la somme des vrai positifs (VP) et des vrais négatifs (VN) détectés par la technique de référence: [C= (VP+VN) InoMust/(VP+VN) Référent] Conclusion Fiche de résultats (Logiciel Inosoft) Dépôts des antigènes Incubateur InoStainer Lame de verre Lecteur InoScan Antigènes Sérologie Figure 3 Figure 4 Figure 5 Figure 2 Figure 1