Obtention de la séquence nucléotidique codante pour la GFP I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc par RT-PCR II- Amplification de l’ADNc codant pour la protéine fluorescente par PCR III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par électrophorèse IV- Purification de l’ADNc pour l’étape suivante

I- Reverse transcription de l’ARN en ADNc par RT-PCR On utilise la RT-PCR pour obtenir l’ADNc totale de l’organisme fluorescent. RT-PCR : reverse transcription de l’ARNm en ADNc, c’est-à-dire que la RT- PCR retranscrit l’uracile de l’ARN en thymine de façon à donner un brin d’ADNc. Comment passe-t-on de l’ARN à l’ADNc ? Schéma : s

II. Amplification de l’ADNc codant pour la protéine fluorescente par PCR Schéma: un cycle de PCR: (spécifiques) X 26 cycles

III- Vérification de l’amplification de l’ADNc par électrophorèse L’électrophorèse permet la migration de l’ADNc du négatif vers le positif (car celui-ci est négatif). Plus la taille est petite, plus la molécule migre vers le pôle positif. *C1  H2O (sans Taq polymérase) *C2  contamination (sans ADN) *C3  sur un organisme non fluorescent (avec de l’ADNc de saumon) *C4  sur un échantillon positif (connu) *T1  sur l’ADNc de méduse Echelle C3 T1 C4 C1 C2 En paires de bases 2 000 1 500 1 000 500

On mesure la distance entre le puits et les résidus fluorescents : échelle contrôle saumon PCR méduse contrôle PCR positif 4cm 6,5 cm   5,5 cm 4,5 cm 5 cm 6 cm L’échelle est : Cm Paires de bases 4 2000 4,5 1500 5 1000 6 500

#Grâce à cette courbe nous pouvons dire que pour: D’après cette échelle on peut tracer la courbe représentative suivante: #Grâce à cette courbe nous pouvons dire que pour: _ C3, le résidu fluorescent dans le gel correspond aux oligonucléotides. _ T1, le résidu fluorescent dans le gel correspond à 750 paires de bases d'ADNc. _ C4, le résidu fluorescent dans le gel correspond à 750 paires de bases d'ADNc.

IV- Purification de l’ADNc pour l’étape suivante Prélèvement au scalpel La purification sert à enlever l’excès de tampon, de dNTP, d’enzymes et d’amorces et donc à obtenir un ADNc pur. On obtient un ADNc pur qui servira pour l’étape suivante. 1000 pb 500 pb

Ce diaporama vous a été présenté par les experts du NCIS: _ Florent _ Virgile _ Elodie _ Alice _ Coline