L’Analyse des expectorations et du NO exhalé en Pneumolgie R. Louis Pneumogie CHU Sart-Tilman, Liege

Les expectorations Pathologies infectieuses Pathologies Tumorales Pathologies inflammatoires Pathologies de surcharge minérale

Pathologies infectieuses

Expectorations spontanées et infections respiratoires “Expectorated sputum is among the least clinically relevant specimens received for culture in microbiology laboratories, even though it is one of the most numerous and time consuming specimens” Bailley and Scott’s Diagnostic Microbiology, 1998 Echantillon obtenu après un effort de toux Contamination minimale par la salive Echantillon placé dans un container stérile Transfert immédiat vers le laboratoire

Critères d’acceptabilité d’un échantillon d’expectorations Taux de cellules épithéliales squameuses < 10/low power field au microscope Taux de cellules épithéliales squameuses < 10/low power field et taux de polynucléaires  25/low power field  échantillon de qualité Adéquat Inadéquat

Expectorations (induites) et infections respiratoires basses Pneumonie à Pneumocystis carinii Mycobacterioses Infections mycotiques Légionelloses

Pneumocystose 32 patients SIDA avec Rx Thorax anormale Induction d’expectorations avec NaCl 3% Fibroscopie avec BAL si pas de Pneumocystis dans expectorations 25 Cas de Pneumocystis Carinii dont 14 détecté par les expectorations  sensibilité de 56% Parmi les 18 patients sans Pneumocystis Carinii dans les expectorations 11 étaient positifs à l’analyse du BAL  VPN de 39% Bigby T et al Am Rev Respir Dis 1986

Tuberculose pulmonaire Frotti d’expectorations coloré au Zielh-Neelsen Macrophages (mauve) contenant le bacille tuberculeux (rouge) Sensibilité: 20 à 80% VPP: 90%

Aspergillose pulmonaire

Pathologie tumorale

Screening du cancer pulmonaire par analyse morphocytologique NCI trial-Mayo Lung Project Homme fumeur > 45 ans Rx Thorax annuelle conseillée Rx Thorax + cytologie des expectorations tous les 4 mois Le nombre de Stade 1 et de cas chirurgicaux étaient plus grand dans le groupe avec screening régulier (respectivement 38% vs 25% et 46% vs 32%) La survie à 5 ans est de 33%! comparée à 15% dans une population contrôle Pas de différence en terme de mortalité totale due au cancer du poumon Incidence de cancer plus grande dans le groupe avec screening régulier ??!!

Contribution relative de l’analyse morphologique des cellules des expectorations vs RxThorax dans le diagnostic du cancer Rx Thorax seule: 76% Expectorations seules: 17% Rx Thorax et expectorations: 7%

Analyse des expectorations dans la détection du carcinome pulmonaire L’analyse morphologique est surtout utile dans le carcinome épidermoïde où on peut diagnostiquer des cancers avec RxThorax normale (78 % au stade 1). Une cytologie positive pour d’autres types cellulaires est généralement une indication de stades avançés (NCI trial USA) Carcinome épidermoïde Adénocarcinome Des techniques “d’immunostaining” pour des antigènes fœtaux améliorent la sensibilité de l’analyse morphologique (hnRNP = heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) Détection de mutations géniques (K-ras oncogene ou p53) sur des cellules d’expectorations identiques à celle retrouvées dans le tissu cancereux 1 an avant le diagnostic clinique

Pathologie inflammatoire

Induction des expectorations Nébuliseur ultrasonique avec un débit de 1-3ml/min Liquide hypertonique (3-5%) Spiromètre ou peak flow meter Prémédication du sujet avec 400 µg salbutamol (MDI+Spacer) Temps d’inhalation de 10 à 20 min avec collecte toutes le 5 min d’un échantillon d’expectorations qui doivent être “poolés”

Whole sputum Plug Pour entire expectorate into preweighed polystyrene tube and weigh Select viscid or denser portion of the expectorate using an inverted microscope and place in preweighed polystyrene tube Add DTT (DTE) 0.1% solution equivalent to 4 times the weight of the plug Add equal volume of DTT (DTE) 0.1% Place in shaking waterbath or rocker for 15 min at 22°C Filter through 48mm nylon mesh Perform manual TCC and assess viability Centrifugation 1500 rpm 10 min at 4°C Perform DCC on cytospins stained with GIEMSA(> 400 nonsquamous)

Differential sputum cells on cytospins 2 5 1. Macrophage 2. Neutrophil 3. Eosinophil 4. Epithelial cell 5. Lymphocytes 1 4 3

Cytologie des expectorations induites Pathologie Cellule Eosinophiles Neurophiles Lymphocytes Asthme Bronchite chronique non tabagique Exposition à des aéroallergènes ou des sensibilisants professionnels BPCO sensible aux corticoïdes Tabagisme BPCO Exposition aux endotoxines, à l’ozone Asthme résistants aux corticoïdes Infection BBS Chlamydia Pneumoniae

Eosinophilic pneumonia Fungal infection Asthma Chronic bronchitis Curschmann’s Spirals Charcot-Leyden cristal Asthma Eosinophilic pneumonia Fungal infection Asthma Chronic bronchitis

Left ventricular dysfunction Severe asthma COPD Massive eosinophilia Massive neutrophilia GERD Left ventricular dysfunction Lipid laden macrophages Haemosiderin laden macrophages 100 µm

Induced sputum in asthma Pin I et al Thorax 1992

Mild to moderate steroid naive asthma Louis R et al Allergy 2002

Sputum eosinophil counts in asthma Louis R et al Am J Respir Crit Care Med 2000

Sputum eosinophil influx during a late phase bronchospasm Bettiol J et al Allergy 2002

Baseline sputum cell counts before tapering Inhaled corticosteroids Solid symbols: Exacerbation Open symbols: No exacerbation Jatakanon A et al Am J Respir Crit Care Med 2000

Effect of exacerbation of asthma on changes in sputum eosinophils and FEV1 Jatakanon A et al Am J Respir Crit Care Med 2000

Sputum eosinophilia and withdrawal of inhaled steroids Giannini D et al Clin Exp Allergy 2000

Steroid naive patients Proportion of mild to moderate asthmatics with raised sputum eosinophilia Steroid naive patients N = 118 40 31% 30 69% Proportion of patients (%) 20 10 Sputum eos < 2% Sputum eos > 2% < 2 >2-5 >5-10 >10-15 >15-20 > 20 Sputum Eosinophils (%) Louis R et al Allergy 2002

Accuracy of several tests to diagnose mild to moderate asthma 100 75 Accuracy (%) 50 25 PC20M < 8 mg/ml Sputum eos > 1% Blood eos > 6.3% FEV1/FVC < 76.6 % PEFA%M > 21.6% BD response > 2.9% Hunter G et al Chest 2002

Non eosinophilic corticosteroid unresponsive asthma Pavord I et al Lancet 1999

Sputum eosinophilia as a predictive factor for response to inhaled corticoids in asthma 20 Eos > 3% 10 p<0.05 Eos < 3% Change in symptoms VAS (mm) -10 -20 -30 -40 Pavord I et al Lancet 1999

Sputum eosinophilia as a predictive factor for response to inhaled corticoids in asthma 3.0 Eos > 3% 2.5 Eos < 3% 2.0 NS 1.5 Change in PC20 (DD) 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 Pavord I et al Lancet 1999

Sputum guided treatment adjustment   Step down anti-inflammatory treatment Step down bronchodilator treatment   Step down anti-inflammatory treatment Step up bronchodilator treatment SPUTUM EOSINOPHILS 1-3% Step up anti-inflammatory treatment No change in bronchdilator treatment No change in anti-inflammatory treatment SPUTUM EOSINOPHILS >3% No change in anti-inflammatory Step down bronchodilator treatment Step up bronchdilator treatment once on maximum anti-inflammatory treatment SPUTUM EOSINOPHILS <1% Symptoms controlled Symptoms not ANTI-INFLAMMATORY TREATMENT: 1.) Low dose inhaled steroid (100-200mg BDP bd)  2.) Moderate dose inhaled steroid (200-400mg BDP bd) 3.) High dose inhaled steroid (400-1600mg BDP bd) 4.) High dose inhaled steroid (400-1600mg BDP bd) plus leukotriene antagonist 5.) Higher dose inhaled steroid (1600mg BDP bd) plus leukotriene antagonist 6.) Higher dose inhaled steroid (1600mg BDP bd) plus leukotriene antagonist plus oral Prednisolone 30mg 2/52, then titrating dose reducing by 5mg/week BRONCHODILATOR TREATMENT 1.) Long acting b2 agonist 2.) Long acting b2 agonist plus theophylline 3.) Long acting b2-agonist plus theophylline plus nebulised bronchodilator   Green et al. Lancet 2002

Severe exacerbations (cumulative number) BTS guidelines sputum guidelines 120 6 asthma admissions 100 80 Severe exacerbations (cumulative number) 60 40 1 asthma admission 20 ‡p=0.01 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Time (months) Green et al. Lancet Lancet 2002

Traditional management 1705 1660 Inh corticosteroids (mcg/day) 3.0 2.6 Oral corticosteroids (mg/day) 12 Theophylline (n) 15 13 Leukotriene antagonists (n) 11* 4 Nebulised beta2 agonists (n) Long acting beta2 agonists (n) Traditional management Sputum management Treatment *p<0.05 Green et al. Lancet in press

Induced sputum in asthma Sputum eosinophilia is present in 70% of steroid naive asthmatics Measuring sputum eosinophil count together with methacholine bronchial responsiveness are the best ways to diagnose mild to moderate asthma Non eosinophilic asthmatics with prominent sputum neutrophilia seems to resist to inhaled corticoids Exacerbation of asthma is often associated with sputum eosinophilia Targeting sputum eosinophil count for adjusting the dose of inhaled corticoids in moderate to severe asthmatics help in reducing asthma exacerbation

Asbestose pulmonaire Asbestos body Sensitivity is lower in sputum than in BAL 75-100 % vs 25% Specificity is higher in sputum > 95%

Le NO exhalé

Le NO dans les voies aériennes

7. Analyseur de NO (Monoxyde d’Azote) Mesure « on line » par chemoluminescence au cours d’une expiration de 10 sec contre une résistance Valeur moyenne normale : 21 ppb (part per billion) Valeur significativement accrue: > 45 ppb

EBC in children Exhaled NO in children Aerocrine

Mesure du NO exhalé Flux expiratoire constant durant 10’’ Débit expiratoire fixé à 50 ml/sec Contre une résistance Mesure durant les 4 dernières secondes 3 mesures réalisées et moyenne de ces 3 mesures

Nasal vs bronchial NO Karadag et al 1999

Raised ExNO in asthmatics Kharitonov S et al AJRCCM 2001

Epithelial activation as a source of exhaled NO in asthma Healthy subject Asthmatics

Performance of sputum eosinophil count vs exhaled NO for diagnosing asthma Steroid naive patients Steroid treated patients Cut-off: 17 ppb Cut-off: 0.08% Cut-off: 0.3% Cut-off: 15 ppb Solid line: sputum eosinophils Dashed line: exhaled NO Solid line: sputum eosinophils Dashed line: exhaled NO Berlyne G et al JACI 2000

Performance of PEF variability, exNO and sputum eosinophil count to diagnose asthma 20 ppb 3% Sp Eo PEF Ex NO Solid line: variability in PEF Dashed line: change in mean morning PEF after inhaled steroids Solid line: NO (best cut-off 20 ppb) Dashed line: Sputum Eosinophils (best cut-off 3%) Smith A et al Am J Respir Crit Care Med 2004

Use of exNO to guide treatment in asthma Smith A N Engl J Med 2005

Use of exNO to guide treatment in asthma Smith A N Engl J Med 2005

Use of exNO to guide treatment in asthma With the use of FeNO measurements, maintenance doses of inhaled corticoids may be significantly reduced without compromising asthma control Smith A N Engl J Med 2005

Nasal and exhaled NO in children with PCD Karadag et al 1999

Factors affecting exhaled NO levels Airway viral infection Allergic rhinitis Nitrate-rich diet + Spirometric maneuvres Exercise Alcohol Bronchoconstriction Ciliary dyskinesia Hypertension Smoking -