Nouvelles approches thérapeutiques dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Cellule souche leucémique Fréquence faible 1 /1000 000 Auto renouvellement:Modèle souris Bim-1,Wnt/beta caténine,Notch Différentiation CD34+/CD38- CD3+ GPA+

LSC Phénotype CD34+;CD38-,Thy-;CD123+,CD90-,CD117- CD33+/- Quiescente dans 95% des cas en phase G0 Activation consécutive NFkb;STAT5; PI3K;Ras Interferon regulatory factor:IRF-1 Death associated Protein Kinase:DEPK Exprime mdr et Bcl2

Modèle de leucémogénèse en deux étapes: Gilliland DG Mutations AML1 C/EBPa PU-1 ? CSL Blocage de la différenciation Mutations de type II AML1/ETO CBFb/MYH11 PML/RARa Fusions MLL Mutations de type I Mutations activatrices de FLT3 Mutations de c-Kit Mutations de N-Ras et K-Ras Effets sur la prolifération et la survie LAM

Association entre événements Géniques CBF C-Kit dans 30 a 40% des cas Impact négatif Flt3 IDT -KT normaux /M3 -AML1 muté dans 60% pour M0 -Association MLL Dup 50 % Topo trans 64 % CEBP/ KT normaux 15% Pas association avec Flt3 Pas association avec CBF Impact positif GATA-1 M7 Sd de Down

Inhibition de TK et des voies de Transductions

Inhibition de l’activation de FLT3

Structure de FLT3 et mutations les plus fréquentes ITD D835Y Duplication en tandem de la région juxtamembranaire membrane cellulaire JM C-terminal

Rationnel des inhibiteurs de FLT3 ITD Blocage de la différenciation par répression de CEBP/a Auto-renouvellement des cellules CD34+ via STAT5 ? Avantage de prolifération STAT5 Ras/MAPK PI3K Prolifération Survie cellulaire

t(15,17), caryotypes normaux (ITD 32%, D835Y 14%) FLT3 25% des LAM de l’adulte t(15,17), caryotypes normaux (ITD 32%, D835Y 14%) t(8,21), inv (16), 11q23, rare dans les caryotypes complexes 33% des LAM1 avec mutation de CEBP/a ? ITD Hyperleucocytaire, pronostic adverse dans les caryotype normaux D835Y Rapport ITD/allèle normal, délétion allèle normal, mutations des 2 allèles Valeur pronostique ?

Inhibiteurs de Flt3 SU11248Fiedler Onc 2003 SU11248 CEP701 PKC412 Traitement Patients Réponse Durée SU11248Fiedler Onc 2003 21wt,Itd 5 (2Flt3*) SU11248 Fiedler Blood 2005 16wt,ITD 4/4 Itd 2/7WT 2 a 7 semaines Disparition de Flt3* CEP701 Allebach Blood2004 14Itd 5 Amélioration 2 a 15 semaines Corrélation activité déphosphorylation PKC412 Stone Blood 2005 20Itd 2RC;4RP 9et 47semaines MLN518 De Angelo Blood 2004 Sang 6(92%) Moelle 6(62%) 1 et 15 semaines

Questions Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM Évènement secondaire. Tardif ? Probablement Expression de l’ITD dans un sous clone ? Sûrement Mutations présentes dans le compartiment de CSL ? Probablement pas Indication chez les patients FLT3 non mutés ?

Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM Mécanismes de résistance ? Pas de mutation secondaire de FLT3 actuellement décrite Mécanismes de résistance intrinsèque La sensibilité aux inhibiteurs diffère selon le type de mutation D835 ou de ITD (Clarck JJ, Blood, 2004, July 15) Mutation G697R proche de la boucle d’activation: résistance totale à PKC412, CEP-701, SU5614 (Cools J, Cancer Research, 2004, 64, 6385)

Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM l’avenir ? Patients en première ligne de traitement Association à la chimiothérapie - Effet synergique in vitro avec Aracytine et Daunorubicine (Yee KWH, Blood, 2004, August 10) Diminution des doses de chimiothérapie chez les sujets agés ? - Importance de la séquence d’administration (Levis M, Blood, 2004, May) Association à l’inhibition de voies de signalisation situées en aval ?

Inhibition du récepteur c-KIT

c-Kit dans les LAM 60-80% des LAM expriment c-KIT surexprimé (10%) le SCF fait proliférer les blastes in vitro Rôle paracrine+ Rôle autocrine ? Prolifération Survie migration

Mutations de c-Kit dans les LAM incidence globale < 5% c-Kit Association particulière avec les LAM CBF+ Care RS, BJH, 2003, 121, 775 110 LAM de novo 63 inv16 47 t(8,21) D419 23.8% 2% D816 7.9% 10.6% total 31% 12.6% FLT3* 7.9% 5.6% hyperleucocytaire, pronostic adverse ? 43.6% D419 délétion/insertion mutations de l’Exon 8 mutation activatrice probable D816

Mutations de c-Kit D419 Glivec ? PKC412 ? autres: MLN518, PD180970 ? délétion/insertion mutations de Exon 8 Glivec ? PKC412 ? autres: MLN518, PD180970 ? BMS D816 Résistance au glivec Sensible au PKC412 Sensible MLN518

Inhibition de c-Kit Mesters RM, Blood, 2001, 98, 241 Femme 62ans LAM4 réfractaire. c-KIT+, VEGFR2 (KDR)+, FLT3 ? del9q SU5416: 145mg/m2/jour IV RC obtenue en 12 semaines d’une durée de 4 mois Diminution de l’angiogénèse médullaire Kindler T, Blood, 2003, 101, 2960 Homme 64 ans LAM2 secondaire à ASIA, trisomie 8, c-KIT+ non muté, PDGFR+/- Glivec: 600mg/jour RC obtenue en 5 semaines d’une durée de 5 mois Amélioration cytogénétique

Essai de phase II par le Glivec dans les LAM (Kindler T, Blood, 2004, 103, 3644) 21 patients c-KIT+ non mutés, avec phosphorylation du récepteur Glivec 600mg/jour Bonne tolérance 5 réponses, dont deux RC mais administration à J31 et J24 d’une chimiothérapie et 2RP

Inhibition du récepteur au VEGF

Néoangiogénèse dans les LAM Padro T, Blood, 2000, 95, 2637 Augmentation de synthèse du VEGF

Système VEGF/VEGFR dans les LAM VEGFR1 (flt1) et VEGFR2 (KDR/flk1) Autocrininie - Extracellulaire - Boucle autocrine intracellulaire

Inhibition du VEGF dans les LAM SU5416 (KDR, c-KIT, FLT3) Stopeck GFJ, Blood, 2003, 102, 795 Fiedler W, Blood, 2003, 102, 2763 SU11248 (KDR, PDGF, FLT3) Fiedler W, Blood, 2005 105 Rôle a préciser Fiedler2003 1 RC sur 25patients

Voie NF-kB dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Voie NF-kB et cellules souches leucémiques Guzman ML, PNAS, 2002, 99, 16220 Activation NF-kB constitutive dans les CSL IKK IkBa NF-kB Noyau Protéasome Gènes anti-apoptotiques, prolifératif kB site binding ? S32 a,b,g S34 L’inhibition de la translocation de NF-kB induit une apoptose p53 dépendante . Inhibiteur du protéasome . Inhibiteur du protéasome + Idarubicine . IkBa super-répresseur Comment est activée la voie NF-kB ? Comment inhiber spécifiquement NF-kB ?

Inhibiteur de NFkb Romano et Al Leukemia 2003;1190

Inhibiteur de NFkb Frelin c et al Blood 2005,804 Utilisation de AS602868 inhibiteur de IKK Potentialisation vis a vis Ara c VP16 Doxorubicine Abolition de Phosphorylation NFb Activation de la caspase-3 Étude de phase 2

Voie de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K/AKT) dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Voie de la phosphoinositide 3-kinase/AKT GAB RTK P TK p110 a,b,d p85 PI3K PI(4,5)P2 PI(3,4)P2 PI(3,4,5)P3 SHIP-1 PTEN AKT PDK1 PDK2 Thr308 Ser473 P mTOR P croissance FOXO3a BAD Fas-L Bim Survie MDM2 p53 GSK3 Cyclin D1 Prolifération IKK NF-kB

Il existe une activation constitutive de la voie PI3K/Akt dans 50% des LAM Déprivation 2H 4H 8H P35, LAM4, blastes 90% p-Akt (Ser 473) p-FOXO3a (Thr 32) Actine Indépendante du FAB Avantage de croissance in vitro Indépendante des mutations de FLT3

L’IC87114 (inhibiteur de la p110delta) inhibe la prolifération des blastes PI3K+ P51, LAM2, blastes 88% 20000 Patient 51 LY294002 (25µM) : - + - 18000 IC87114 (10µM) : - - + 16000 14000 p-Akt (Ser 473) 12000 10000 p-FOXO3a (Thr 32) 8000 6000 Actine 4000 2000 Milieu LY 294002 IC 87114 L’IC87114 n’a pas de toxicité sur les cellules CD34+ normales Interet pour une phase 1-2

La voie mTOR/P70S6K/4E-BP1

Activation constitutive de la PI3K Hypersensibilité à la rapamycine mTOR Rapamycine Rad-001 CCI-779 FKBP-12 Arrêt du cycle cellulaire Apoptose Inhibition de l’angiogénèse Rapamycine

Inhibition de la voie mTOR en clinique ?

12 patients (Octobre 2003-mars 2004) Etude pilote. C Récher 12 patients (Octobre 2003-mars 2004) Age médian: 72 ans (55-77) Réfractaire (n=4) / Rechute (n=5) / Secondaire (n=3) Rapamycine (sirolimus, Rapamune®, Wyeth) 6 mg à J1 puis 2 mg/J pendant 28 jours Réponse hématologique: Réduction de plus de 50% des blastes sanguins et/ou médullaires

Etude pilote. C Récher Pharmacocinétique variable+++ 4 réponses, 7 progressions et 1 stable à J28 Durée de traitement: 50 (21-240) Durée de réponse= 38 jours (35-120) 2 répondeurs vivants à 9 et 11 mois

4 répondeurs à J28

Voie des protéines JAK/STAT dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

La voie d’activation des facteurs de transcription STAT JAK JAK P P P P Stat P P P Stat Stat Cytoplasme P X FT c fos c-myc Noyau

La voie JAK/STAT dans les LAM Activation constitutive de STAT3 et/ou STAT5 dans 30-70% des LAM Activation associée aux mutations de FLT3 ? L’activation constitutive de STAT3 confère un pronostic Adverse (DFS) Benekli M, Blood, 2002, 99, 252 Rôle dans la prolifération, la survie des cellules blastiques ? Auto-renouvellement ?

Inhibition de la voie JAK/STAT AG490 CIS/SOCS JAK JAK Activation de phosphatases SHP1/SHP2 PP2A Inhibition de la dimérisation STAT3: PY*LKTK PIAS STATs Anti-sens NH2 COOH SH2 DBD TA Y LD STATs Inhibition de la transcription STAT3 DN Séquences consensus ADN

Voie des protéines Ras-ERK/MAPK dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

Signaux extracellulaires Progression dans le cycle FTI RAS Survie Bad RAF MEKK PD 98059 UO126 Bad 14.3.3 MEK MAPKK BclX MAPK Rsk BclX MAPK Rsk C- myc Elk-1 Ap1 Histone H3 SRE cdc25 Cyclines D Progression dans le cycle

La voie Ras; ERK/MAPK dans les LAM Activée dans 50-90% des LAM, indépendamment des mutations activatrices de Ras Contrôle la prolifération et la survie des cellules blastiques Thérapeutique:Synergie sur l’induction d’apoptose avec l’inhibition de l’expression de Bcl-2 (AS)

La voie Ras; ERK/MAPK dans les LAM Phase 1 FTI dans les LAM Karp Blood2001 35 patients 2RC durée de 3 a 7 mois et 6 RP Dose entre 600mg et 1200mg Phase 2 FTI dans les LAM réfractaires et en rechutes Harousseau ASCO 2002 17% de RC Phase 2 LAM non traitée et les SMD Blood2002 34% de réponse dont 12 RC Indépendamment de l’inhibition de la Farmestylation et mutation Ras

Induction de l’Apoptose en bloquant les voies anti apoptotiques : modèle des anti Bcl-2 Genasense:G3139 Peptides anti Bcl-2

Genasense et LAM Phase 1 Genasense and FLAG in relapse or refractory leukemia Marcucci et al Blood 2003;425 17 LAM réfractaire ou en rechute (médiane 7 mois) Genasense de J1 a J10 et FLAG de J5 a J10 5RC et 2 RCu entre 83 et 565 jours La durée de 2Rc est supérieur a la première Phase 2 Moor et al Blood2004 39 Patients LAM en rechute ,age >60 ans Association Genasense et Mylotarg (9mg) 30% de RC ou RCu

Peptides interagissant entre Bcl2 et BAX Shangary et Al Mol Cancer Ther 2004;3 Peptides interagissant avec BH3BAX libère BAX et induit apoptose Peptides de 15 AA qui interviennent dans BAX-Bcl-xL et BAX Bcl2

Les Anticorps Anti CD33 avec calicheamicin Anticorps I131 ou Y80 Anticorps DT

Mylotarg et LAM Mylotarg Mylotarg+/-IL11 Estey Blood2002 Sievers J clin Onc 2001 142 LAM Rechute 9mg/m2x2 30% RC Nabhan Leuk rec2005 12 LAM NT 6mg/m2x2 27% RC Mylotarg+/-IL11 Estey Blood2002 51LAM SMD 8%sans IL11 36%avec IL11 Influence du KT Fluda Arac ciclo Estey Cancer 2003 49 LAM 6mg/m2 48% RC +IA Estey Leu chemo Pharma2003 14 LAM Réfractaire 47% RC

Anticorps et DT DT-GM DT-IL3 DT-Urokinase (CD87) Frankel et al Clin Cancer Res 2002 1RC sur 34 LAM rechute réfractaire Problème Anticorps neutralisant (30%), Hall PD Clin Immunol 2001 Toxicité hépatique DT-IL3 Toxicité sur les LSC et non les HSC,Frankel Leukemia 2000 Inhibe la colonisation des NOD/SCID par les LSC et non les HSC Black Leukemia 2003 DT-Urokinase (CD87) Présent sur les cellules souches

Anti CD44 Inhibiteur des Histones deacethylases DIFFERENTIATION Anti CD44 Inhibiteur des Histones deacethylases

Anti-corps activant CD44 Récepteur de Ac Hyaluronique Présent sur les cellules souches normales et leucémiques Blocage inhibe la myélopoiése Induit la différentiation de lignées myéloïdes: NB4,THP-1,HL60 Bloque apoptose induit par la chimiothérapie(Doxo,VP16,Mitoxantrone) Inhibe la greffe secondaire des CSL dans des NOB/SCID

Différentiation et CD44 F Smadja-joffre Nature Med 1999 CD14/CD15 Cytologie LAM3 70% 79% DIFFERENTIATION LAM5 41% 58% LAM4 30% 32% LAM1/2 20% 42%

Mode action des CBF

Mode action des CBF Dominant négatif sur la synthèse de gènes GM-CSF;P21;CBF Activateur de génes cibles Bcl2 ;Mdr Bloque la différentiation :Rôle des HDAC

Inhibiteurs des HDAC Butyrate Acide Hydroxamique(acide suberoylanilide ou SAHA) Tetrapeptides cycliques(Depsipeptide) Benzamides (MS-275) Acide cinnamique Hydroxamate(NVP-LAQ824) Acide Valproique

Mode action des HDACI Les HDACI Interet dans les LAM Apoptose par: expression de TRAIL et de son Récepteur Blocage de la prolifération par: expression de la P21 Induise une différentiation par: expression de la P21 Interet dans les LAM Nebbioso A Nature Med 2005 61 patients 90% présente une apoptose Weisberg E Leukemia 2004

HDACI MS275 Nebisso Nat Med 2005 Différentiation Apoptose

Conclusion 1 L’avenir est il à l’association concomitante de plusieurs inhibiteurs ciblant des RTK et des protéines de signalisation? Probablement oui Diminuer le risque d’émergence de mécanismes de résistance aux inhibiteurs de RTK Restaurer une sensibilité aux inhibiteurs de mutants résistants de RTK Augmenter le degré d’inhibition d’une voie de signalisation en l’inhibant à plusieurs niveaux d’activation Potentialiser les effets apoptotiques

Mohi MG, PNAS, 2004, 101, 3130 FLT3 ITD TSC1 Akt TSC2 PKC412 Rheb GDP Rheb GTP TSC1 PI3K Akt TSC2 Ras sensibilité restaurée d’un mutant résistant à PKC412 rapamycine < PKC412 + rapamycine mTOR Raf P70S6K UO126 < PKC412 + rapamycine + U0126 MEK 4E-BP1 MAPK

CONCLUSION 2 -Association a la chimiothérapie traditionnelle? Oui pour agir sur ensemble des cellules leucémiques -Faut il mieux caractériser les LAM ? Sûrement il faudra a avenir: Connaître les anomalies des TK Des voies activationsPI3K,STAT ;Ras ,ERK -Quels sont les drogues a tester ? Les inhibiteurs de TK :BMS Les Inhibiteurs de NFb Les HDACI