Caractérisation et quantification des populations de Légionelles naturellement présentes dans la rivière « Le Tech » Nathalie Parthuisot 2006 - 2009 École Doctorale de Biochimie et Biologie Moléculaire B2M Université Paris Diderot-Paris 7 Université Pierre et Marie Curie-Paris 6

Introduction La Légionellose Les Légionelles Maladie infectieuse bactérienne, connue depuis l’épidémie de 1976 . Deux manifestations cliniques : fièvre de Pontiac / infection pulmonaire grave Les épidémies en constante progression Ces infections sont graves Les Légionelles C’est un bacille Gram-, aérobie, flagelle monopolaire, mesure 0.5µm (largeur) et 2µm (longueur ) 49 espèces décrites. Legionella pneumophila est la plus virulente pour l’homme (plus de 80% des cas déclarés)

Sources et réservoirs Les milieux aquatiques naturels : Légionelles : bactéries ubiquitaires de l’environnement, qui se développent dans : Les milieux aquatiques naturels : eaux douces : les rivières, torrents et lacs eaux marines et des sols mouillés ou humides. Les milieux aquatiques artificiels : réseaux d’eau chaude (hôpitaux, hôtels, immeubles) les systèmes de climatisation, thermes, spa (…) mauvais entretien du réseau d’eau La contamination à l’homme : inhalation d'aérosols contaminés Cependant, on ne connait pas les sources et les réservoirs naturels environnementaux des Légionelles.

Interactions facteurs environnementaux Paramètres physico chimiques pH Température Facteurs biotiques : Protozoaires Multiplication (Abu Kwaik 1998) Rescucitation (Garcia 2007) Flore associée Inhibition (Temmerman 2007) Multiplication (Yammoto 1992) Biofilm Protection, Nutrition (Murga 2001, Storey 2004)

Interactions facteurs environnementaux Etats physiologiques : Quels facteurs permettent aux Légionelles de se multiplier ? Quels facteurs de stress entrainent la survie des Légionelles ? Les Légionelles sont elles capables d’évoluer vers des états Viables Non Cultivables (VNC) ? Quels facteurs induisent ces états et quelle est l’occurrence des Légionelles VNC en milieu naturel ? Devenir : Comment acquièrent-elles leur virulence ? Et comment évaluer le risque sanitaire ?

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Ecologie complexe Interactions facteurs environnementaux : Paramètres physico chimiques Flore associée Ecologie des légionelles Rivières, torrents, lacs Sources / Réservoirs : Etats physiologiques : Milieux aquatiques naturels, Milieux aquatiques artificiels Multiplication Survie Viables Non Cultivables Evolution dans réservoirs : Virulence Risque sanitaire Thèse : Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles

Dynamique des Légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech » Identification des sources et des réservoirs environnementaux Présentation site d’étude : Le Tech Sources principales de contamination / stations analysées Bassin versant de 750km2, sur 85 km 4 tronçons Haut Vallespir, montagneux, boisé, réseau hydrographique torrentiel Moyen Vallespir, Bas Vallespir, Plaine du Roussillon, zone agricole, urbanisation moyenne, répartie le long du Tech Sources pollution Rejet industriel (Amélie) Les thermes (La Preste, Amélie, Le Boulou) Les stations d’épuration (mauvais fonctionnements)

Le Tech (1) Fleuve côtier, extrémité sud des Pyrénées-Orientales. Source : massif du Costabonne (2345 m) Ecoulement sur 85.7 km, bassin versant de 780 km2

Le Tech (2) Réalisation de la carte : année 2000 4 tronçons Haut Vallespir, montagneux, boisé, réseau hydrographique torrentiel Moyen Vallespir, Bas Vallespir, avec centres urbains importants Plaine du Roussillon, zone agricole, urbanisation moyenne, répartie le long du Tech Sources pollution Rejet industriel (Amélie) Les thermes (La Preste, Amélie, Le Boulou) Les stations d’épuration (mauvais fonctionnements) Réalisation de la carte : année 2000

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Etude de la dynamique des légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech » Suivis mensuels et saisonniers, des 9 stations : Quantification des L. pneumophila totales, Quantification des L. pneumophila actives et Quantification des L. pneumophila cultivables Occurrence in situ des formes VNC Analyse de la diversité spécifique des Légionelles Influence des paramètres environnementaux

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Développements méthodologiques (eaux et sédiments) : Méthodes de détection : Culture (norme AFNOR) PCR Immunofluorescence Optimisation double-marquage L. pneumophila actives : Couplage spécificité (anticorps monoclonal) et activité métabolique Cytométrie phase solide Sédiments : application au préalable d’un gradient de séparation Méthode alternative de quantification des L. pneumophila actives

Marquages immunofluorescents de L. pneumophila actives L. pneumophila cells immunostained Active L. pneumophila cell

Validation protocole de double-marquage Principe : Eau robinet, dopée de 2.103 à 2.107 Lp/litre Paramètres mesurés : L. pneumophila totales, actives et cultivables Résultats :

Suivis mensuels : premiers résultats La Preste Céret L. pneumophila totales L. pneumophila actives Résultats préliminaires

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles Développements méthodologiques (eaux et sédiments) : Analyses des dynamiques des espèces de Légionelles : Méthodes de détection classique : L. pneumophila et quelques Legionella spp Manque d’information sur dynamique intra-spécifique Optimisation outil d’empreintes moléculaires : CE-SSCP variations spatio-temporelles des espèces variations des espèces en fonction des stations Outil de quantification moléculaire (PCRq en temps réel) : Suivre variations Legionella spp et L. pneumophila

Conclusion Etude de la dynamique des légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech » Résultats préliminaires : Concentrations L. pneumophila totales (vivantes et mortes) non négligeables Concentrations faibles en L. pneumophila actives : 0.02 à 1% L. pneumophila totales Quantifications de L. pneumophila viables non cultivables Outils pertinants pour étudier dynamique des Légionelles Perspectives : Dynamiques saisonnières et stations-dépendantes Influence des facteurs environnementaux