Faculté de pharmacie Amiens ENZYMOLOGIE (PACES) Pr S. Kamel Faculté de pharmacie Amiens Biologiste CHU Amiens

CATALYSEURS = PROTEINES = ENZYMES I - INTRODUCTION 3 caractéristiques pour une réaction chimique dans la matière vivante : Rapidité Température peu élevée Spécificité CATALYSEURS = PROTEINES = ENZYMES Réactions du métabolisme (régulation ++ : production de métabolites) Intérêt fondamental Pharmacologie moléculaire (inhibiteurs d’enzymes = médicaments)

Alpha-galactosidase

Site actif = ensemble d’ acides aminés (AA) Interaction substrat + AA (liaisons de faible énergie) Rapprochement ++ des espèces moléculaires Effet de voisinage (différence ++ avec la chimie : pas d’agitation moléculaire)

Equation de Michaelis et Menten

Km : affinité Km : affinité

Km est indépendant de la concentration d’enzyme

Unité de l'activité enzymatique L'activité enzymatique d'une solution est le nombre de mole de substrat qu'elle dégrade par seconde Katal (Kat) L'unité officielle de la mesure de l'activité enzymatique. C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mole de substrat par seconde L'unité international (U.I) unité très usuelle C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mmole de substrat par minute 1UI= 16nKat. Dosage La mesure de l'activité enzymatique d'une solution permet de doser une enzyme. Il faut faire la mesure dans des conditions définies de pH, de T°(souvent 37°), de [S], …)

Représentation de Lineweaver et Burk

pH optimal voisin de 7 (enzymes actives à pH acide ou alcalin) mesure de l’activité d’une E dans des conditions définies de pH et de T°

III- Les Effecteurs d’Enzyme Michaeliens 1 – Définition Molécule chimique qui par sa liaison avec l’enzyme (ligand) module la vitesse de la réaction enzymatique : - en l’accélérant = activateurs (ions divalents Zn++) - en la ralentissant = inhibiteurs (applications pharmacologiques) 2 – Cas de l’inhibition irréversible E + I E I Liaison covalente

- DFIP = gaz neurotoxique - Autre ex : pénicilline (inhibiteur irréversible de la transpeptidase bactérienne)

3-2 Inhibition non compétitive Inhibiteurs non compétitifs ≠ analogue structural

3-3 Inhibition uncompétitive (anticompétitive)

Hydroxyméthylglutaryl CoA Autres exemples d’inhibiteurs enzymatiques Acyclovir : inhibiteur de la thymidine kinase virale Pénicilline : inhibiteur de la transpeptidase bactérienne Statines : inhibiteur de l’HMG coA réductase = hypocholestérolémiant CoA - Membranes - Acides biliaires - Hormones Stéroides AcétylCoA 2 NADPH 2 NADP+ 2H+ ... AcétoacétylCoA (HMG CoA) réductase - Mévalonate Hydroxyméthylglutaryl CoA (HMG CoA) cholestérol Statine (lovostatine)

IV – Les enzymes allostériques 1 – Allostérie : définition Ex : Myoglobine et hémoglobine ≠ Enzymes Myoglobine (Mb) : - O2 dans le cytoplasme - 1 chaîne polypeptidique (153 AA) - 1 molécule d’héme Hémoglobine (Hb) : - O2 dans le sang (GR) - 4 chaînes polypeptidiques (tétramères) 2a et 2ß - 4 molécules d’Hème (4 O2) Courbe de saturation en O2 de la Mb et de l’Hb : - Pour Mb : Hyperbole - Pour Hb : Sigmoïdes

Interprétation : Mb : 1 chaîne polypeptidique cinétique de saturation michaélienne Hb : 4 chaînes polypeptidiques = oligomère (structure quaternaire) Fixation d’une molécule d’O2 sur une sous unité entraîne une modification conformationnelle d’une autre sous unité qui est alors capable de fixer une autre molécule d’O2 : effet de coopérativité positive = protéine allostérique (intérêt physiologique +++)

Allostérie : propriété de certaines protéines actives oligomériques (transporteurs, canaux, pompes, enzymes…) de changer de structure spatiale lorsqu’elles se lient à une molécule de ligand (substrat ou effecteur), cette liaison se traduisant par une modification d’activité. Site actif impropre à la fixation du substrat Forme T (tendue) Transition allostérique Site actif permettant la fixation du substrat Forme R (relachée)

2 – La cinétique allostérique

3- Modèle d’interprétation 3-1 Modèle concerté de Monod, Wyman et Changeux

3-2 Modèle séquentiel de Koshland

4 – action des effecteurs allostériques

5 – Régulation des métabolismes in vivo par les enzymes allostériques 5-1 Définitions Métabolisme : ensemble de réactions biochimiques permettant la synthèse ou la dégradation d’un métabolite (substrat) Catabolisme : voie métabolique conduisant à la dégradation d’un métabolite (glycolyse : dégradation du glucose) Anabolisme : voie métabolique permettant la biosynthèse d’un métabolite (glycogenèse : synthèse du glycogène)

Rétro-inihibition (feedback négatif) Biosynthèse de X ou dégradation de A A B C D…. X E1 E2 E3 E4 Rétro-inihibition (feedback négatif) E1 = enzyme allostérique X = métabolite terminal = inhibiteur allostérique (régule sa propre biosynthèse)

Ex : régulation allostérique de la glycolyse Glucose glucose 6 P Fructose 6 P Fructose 1-6 Bi P Pyruvate production d’ATP++ AMP + PFK Phosphofructokinase Rétro-inhibition Cycle de Krebs [ATP] glycolyse [ATP] (AMP ) glycolyse

V – Coenzymes et groupes prosthétiques

VI – Applications générales des enzymes 1 - Dosage des activités enzymatiques : intérêt en pathologie humaine - Localisation cellulaire LDH : lactate deshydrogénase CPK : créatine phosphokinase ASAT : aspartate aminotransférase

Localisation tissulaire : organospécificité Créatine phosphokinase (CPK) : muscle squelettique, cœur Lactate deshydrogénase (LDH) : foie, cœur Aspartate aminotransférase (ASAT) : foie, cœur Phopshatase alcaline (PAL) : foie, os, placenta Gamma glutamyl transférase : foie, rein

- Méthode en point final : transformation totale