Probiotiques et barrière intestinale: Mécanismes d’action Theodorou Vassilia, PhD Unité de Neuro-Gastroentérologie et Nutrition (NGN) UMR 1054 INRA/EI-Purpan vtheodor@toulouse.inra.fr

Un certain début de l’histoire… Longévité des populations caucasiennes et consommation des produits fermentés (bactéries lactiques)….. Elie Metchnikoff (1845-1916)

Probiotiques: définitions « Probiotiques » terme proposé par Lilly et Stillwell (Science, 1965) : substances secrétées par un micro-organisme stimulant la croissance d’un autre. Micro-organismes et substances issues de micro-organismes contribuant à l’équilibre de la microflore intestinale (Parker et al., 1974). « Micro-organismes vivants exerçant un effet bénéfique vis-à-vis de l’hôte par maintien de l’équilibre de la microflore intestinale (Fuller et al., 1989). «  Micro-organismes vivants qui, ingérés en quantité suffisante exercent un effet positif sur la santé (FAO/WHO)

Probiotiques entité en évolution : De l’ingrédient d’aliment fonctionnel vers l’agent bio thérapeutique…

Qui sont-ils? Bactéries Levures Lactobacilles (différentes souches ) Bifidobactéries ….. E. Coli non-pathogène (E. Coli Nissle 1917) Enterocoques Levures Saccharomyces boulardii

La barrière intestinale microbiote mucus épithélium GALT SNE

Probiotiques: comment agissent-ils? Microbiote lumière Barrière intestinale Immuno- modulation

Probiotiques et pathologies gastro-intestinales Intolérance au lactose Gastroentérites infectieuses Diarrhée associée à l’antibiothérapie Maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) Syndrome de l’intestin irritable (IBS)

(micro-inflammation) Probiotiques / MICI / IBS: rationnel d’utilisation MICI (inflammation) IBS (micro-inflammation) - Changements du milieu intraluminal (flore, proteases…) - Reponse immune au microbiote inappropriée - Barrière intestinale altérée - Changements du milieu intraluminal (flore, proteases…) - Activation immune locale et systémique - Barrière intestinale altérée

Changements qualitatifs et quantitatifs de la microflore MICI (inflammation) IBS (micro-inflammation) ↓du nombre de bifidobactéries et lactobacilles Favier et al., 1997 ; Balsari et al., 1982 ; Malinen et al., 2005 ; Matto et al., 2005)

Intraluminal serine-proteases changes Roka et al., Clin Gastroenterol Hepatol 2007

Critical features of the mucosal immune response in normal vs Crohn disease intestine Strober et al., JCI 2007

Plasma cytokine levels changes in IBS Dinan et al., Gastroenterology 2006

Crohn and Ileo-Colonic paracellular permeability Söderholm et al. Gut 2002

IBS and increased gut permeability Post-infection (acute diarrhea) All subjects Rome I 100 100 No IBS (n=43) Control (n=86) 80 80 IBS (n=67) IBS (n=132) 60 60 * Subjects (%) Subjects (%) * 40 40 20 20 > 0.02 > 0.02 Lactulose-Mannitol ratio Lactulose-Mannitol ratio Marshall et al. Gastroenterology 2006

Probiotiques et mécanismes d’action: 1) Interactions avec des pathogènes et des facteurs endoluminaux

Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 1999 Probiotiques/pathogènes

Expression du peptide antimicrobien human beta-defensin-2 (hBD-2) E.coli Nissle 1917 NF-kB, AP-1 Caco-2 hBD-2 L. paracasei, L plantarum, L frementum, L. gasseri… Wehkamp et al., Infect Immun, 2004 Probiotiques/pathogènes

Inhibition of H pylori by bacteriocins Lactobacilli (Kim et al., 2003) Nisin A, pediocin PO2, leucocin K, lacticins.. x Nisin, lactacin F, autolysin… L. johnsonii La1, L.Acidophilus LB supernatant (Dalmau et al., 2002 ; Coconnier et al., 1998) x urease Probiotiques/pathogènes

Fecal serine-protease activity in IBS-D: a lumenal factor impairing permeability and sensitivity

Intensity dof contractions L farciminis decreases visceral hypersensitivity induced by luminal application of IBS-D fecal supernatants 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 25 50 75 100 125 150 175 Volume of distension (ml) Intensity dof contractions (mV/s) NaCl 0,9%po + IBS-D ic L. farc. po + IBS-D ic NaCl 0,9% po + HC ic L. farc. po + HC ic * Probiotiques/facteurs endoluminaux

L farciminis decreases fecal serine-protease activity of IBS-D fecal supernatants MRS 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 Proteolytic activity UA/mg protein L. farc MCa + véhicule (Tris-HCl 0,2 mM) + IBS-D supernatant * Probiotiques/facteurs endoluminaux

Probiotiques et mécanismes d’action: 2) Interactions avec la barrière épithéliale

Toll-like receptors (TLRs) in bacteria- intestinal epithelial cell (IEC) communication TLR5 TLR2 Bacteria Gram + Hyporesponsiveness (tolerance) Tollip LTA LPS Tollip Hyperresponsiveness (inflammation) TLR4 Bacteria Gram - Cytokines From Otte et al., Gastroenterology 2004

x x L.casei and L. helveticus induce IEC responsivness via a TLR -2 independent pathway Primary culture of colon IEC Anti-TLR2 x ? x Maintained IL-6 release Anti-TLR4 L casei CRL431 L helveticus R389 Probiotiques/barrière épithéliale From Vinderola et al., 2005

VSL3 inhibits nuclear factor-κB and induce heat shock proteins in colonic epithelial cells through proteasome inhibition proteasome NF-kB X Hsp VSL#3 Facteurs solubles Petrof et al., Gastroenterology 2004 Probiotiques/barrière épithéliale

L. farciminis reduces the severity of experimental colitis : role of intestinal barrier integrity % 51 Cr-EDTA , 24 h 2 4 6 Log10 UFC/g MLN Liver Spleen * TNBS TNBS + L. farciminis 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 + Control L. farc. TNBS+Lfarc Colonic permeability Bacterial translocation Probiotiques/barrière épithéliale Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2004

L. farciminis suppresses the increase of colonic permeability induced by an acute stress in rats: interaction with epithelial cells cytoskeleton contraction saline STRESS (45 min) L. farciminis SHAM 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Mean Aera Density * + p-MLC +p<0.05 vs stress 45 min *p<0.05 vs sham Probiotiques/barrière épithéliale Ait Belgnaoui et al., Gut 2006

Number of abdominal contractions/5 min. L. farciminis suppresses stress-induced visceral hypersensitivity through interaction with epithelial cell cytoskeleton contraction Colorectal sensitivity Compliance ++ 60 + ** * 4 + 40 3 * Number of abdominal contractions/5 min. Volume (ml) 2 20 1 15 30 45 60 15 30 45 60 Pressure (mm Hg) Pressure (mm Hg) sham stress stress + L.farciminis Probiotiques/barrière épithéliale Ait Belgnaoui et al., Gut 2006

Effect of a Tight Junction blocker on stress-induced increased colonic paracellular permeability and sensitivity to distension 40 Number of abdominal contractions/5min. Tris * % 51-CrEDTA 35 Tris + Stress * 4 sham 30 TAP + stress *: p<0.05 from sham stress 25 3 stress +TAP 20 * * * + 2 15 + 10 * : p< from control (Tris) 1 5 +: p< from Stress +Tris) + 0,4 0,8 1,2 Basal 0 - 6 6 - 24 hours Volume of distension (ml) TAP: 2, 4, 6, triaminopyrimidine ( Ait-Belgnaoui et al. 2005)

Probiotiques et mécanismes d’action: 3) Interactions avec les cellules immunitaires

Link between physical and funcionnal barrier Increased permeability Basal immunocyte attraction increased MPO - increased cytokine expression (IL-1ß TNF-a, IFN-g…) - bacterial translocation

TLR-9 signaling mediates anti-inflammatory effects of VSL#3 in experimental colitis Dendritic cell Macrophages VSL#3 IL-6, IL-12 TLR 9 CpG-DNA (ISS-DNA) or ISS-ODN chloroquine Anti-inflammatory effects (DSS - TNBS) Rachmilewitz et al. Gastroenterology 2004 Probiotiques/immunomodulation

L. reuteri and L. casei effects through DC-SIGN binding Dendritic cell L. reuteri, L. casei DC-SIGN Treg IL-10 Unknown carbohydrate motif Anti-DC-SIGN Inhibition of bystander T cells Anti-inflammatory effects Smits et al., J Allergy Clin Immunol. 2005 Probiotiques/immunomodulation

L. farciminis releases NO in vivo NO intraluminal 250 500 750 * * # pmol/mg mat. séche/h) Témoin L. farc. SNP SNP + Hb + Hb * ° Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2004 Probiotiques/immunomodulation

L. farciminis reduces TNBS-induced colitis: NO involvement Scores Lésionnels Macroscopiques Activité MPO * 1 2 3 4 5 6 7 1000 2000 3000 4000 * SLM + U/g protèines + TNBS TNBS + L. farciminis TNBS + L. farciminis + Hb L. farciminis Témoins Probiotiques/immunomodulation Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2004

Effect of L. farciminis on mucosal cytokine levels in TNBS colitic rats * 3 7.5 * 6 2 pg/mg of protein IL-1b + 4.5 pg/mg of protein IL-10 3 1 + 1.5 * Control L. farc. TNBS TNBS + L. farc. Control L. farc. TNBS TNBS + L. farc. Lamine et al., Scand J Gastroenterol. 2005 Probiotiques/immunomodulation

L casei attenuates the severity of TNBS-induced colitis (prevents the upregulation of ICAM-1 expression and leukocyte recruitement) Angulo et al Am J Physiol 2006 Probiotiques/immunomodulation

Bifidobacterium infantis normalizes PBMC IL10/IL-12 ratio in IBS patients O’Mahony et al., Gastroenterology. 2005 Probiotiques/immunomodulation

L. salivarius, B. infantis in IBS Composite score of IBS symptoms Dose 1010 CFU, for 2 months O’Mahony et al., Gastroenterology 2005 Probiotiques/immunomodulation

Putative pathways involved in probiotic effects IL-10 Treg TLR-9 ICAM-1 (recrut. leuc.) Cytokines pro-infl Hypo CD4+ (8) MLC (6) (1) (3) (7) (2) (5) NFk-B NFk-B, AP-1 (4) X MLCK X Hsp MLCP X X TLR-2 PARs Serine protéases DC-SIGN CpG-DNA NO Facteurs solubles Facteurs gluc. LTA X hBD2 Inhibiteurs proteases

Probiotics in IBD Clinical evidence Sartor B, Gastroenterology 2004

Probiotics in IBS Clinical evidence Floch GC et al., J. Clin. Gastroenterol 2005

Conclusion Mécanismes d’action de probiotiques: (i) plusieurs voies impliqués dans l’action d’une souche (ii) toutefois ces voies sont espèce-spécifiques (iii) des nouvelles pistes d’investigation dans le dialogue hôte-probiotique: interactions avec le contenu luminal. Des clarifications nécessaires: (i) définition de la sélection des souches de la dose et de la durée des traitements (ii) de la fraction active (bactéries vivantes versus fractions bactériennes ou métabolites (iii) synergies entre souches? (préparations mono versus pluri-souches).

Remerciements UMR1054 INRA-EI-Purpan F. Lamine A. Ait-Belgnaoui H. Eutamene L. Ferrier E. Houdeau M. Leveque C. Cartier L. Bueno J. Fioramonti Universitéy P Sabatier Toulouse III F. Nepveu C: Roques Institut Rosell– Lallemand, Toulouse H. Durand V. Delahaye P. Malard