INFECTION par le VIH Physiopathologie de l’infection par le VIH Aspects Virologiques Les différents VIH Les tests virologiques Dr Diane Descamps Laboratoire de Virologie Hôpital Bichat-Claude Bernard Université Paris 7

HISTORIQUE Découverte du HIV en 1983 LAV : Lymphadenopathy Associated Virus Françoise Barré-Sinoussi laboratoire de Luc Montagnier Institut Pasteur, Paris Découverte du VIH-2 en 1986 isolé à l ’hôpital Claude Bernard Laboratoire de Françoise Brun-Vézinet Caractérisation François Clavel, Institut Pasteur

FAMILLE DES RETROVIRUS SPUMAVIRUS Pathogénicité? ONCOVIRUS HTLV-1, HTLV-2 LENTIVIRUS HIV-1, HIV-2

RETROVIRUS Definition : particules de 100 à 110nm de diamètre Structure ARN monocaténaire 2 sous unités identiques capside icosaèdrique enveloppe sortie de la cellule par bourgeonnement enzyme caractéristique : reverse transcriptase transcription retrograde de l ’ARN en ADN

Réplication du VIH 2 étapes Intégration du virus dans le génome cellulaire enzyme virale : intégrase pas d ’expression des gènes viraux pas d ’intervention de mécanismes cellulaires Synthèse de nouveaux virions régulée par des mécanismes viraux et cellulaires

Co-Récepteurs nécessaires à la pénétration du virus dans la cellule hôte récepteurs de chimiokines : attirant les cellules immunocompétentes aux sites de la réponse immune et de la réaction inflammatoire  co-récepteurs différents CXCR4, CCR5 CCR2b, CCR8, Bonzo, Bob, etc..

Co-Récepteurs Bêta-Chimiokines se fixant sur CCR5 : RANTES, MIP-1a, MCP-1 Alpha-Chimiokines se fixant sur CXCR4: IL-8, SDF1 Expression lymphocytes CD4 macrophages

HIV : tropisme in vivo Récepteur CD4 : Lymphocytes CD4+ Monocytes-Macrophages Cellules folliculaires dendritiques (gg) Cellules dendritiques Cellules de Langherans (muqueuses) Microglie

Tropisme Tropisme macrophagique (M) : CCR5 ou virus R5 90% des souches transmises par voie sexuelle virus peu réplicatifs et peu cytopathogènes : NSI (Non Syncithia Inducing) sujets asymptomatiques délétion de 32paires de bases gène CCR5 synthèse protéine tronquée, non fonctionelle homozygote : 1% (population caucasienne) hétérozygote : 15 à 20%

Tropisme Tropisme lymphocytaire (T): CXCR4 ou X4 hautement réplicatif dans les lymphocytes T activés effet cytopathogène prononcé : SI (Syncithia Inducing) isolés chez tous les patients qui présentent des symptômes biologiques et cliniques Utilisation préférentielle des co-récepteurs liée à la diversité des formes virales coexistant chez un individu infecté : variabilité génétique et dissémination du VIH ?

HIV Envelope Tropism R5-Tropic X4-Tropic Dual-Tropic Mixed-Tropic CXCR4 CCR5 X4-tropic HIV R5-tropic HIV dual-tropic HIV

Cellules cibles et réservoirs du VIH (1) Lymphocytes CD4 Cellules présentatrices de l’antigène monocytes sanguins et macrophages tissulaires réplication faible avec ECP peu important cellules dendritiques : vecteur de réservoir du virus peau, thymus, muqueuses, organes lymphoides, SNC et sang périphérique absorption sur cellules dendritiques des muqueuses génitales et transport aux organes lymphoides voisins par intermédiaire d ’une lectine « DC-SIGN »

Cellules cibles et réservoirs du VIH (2) CD4 activés 99%de la réplication virale libération de virus dont la demi vie est très courte CD4 non activés = cellules mémoires chez les patients traités : virus persiste sous forme de DNA proviral non défectif, infectieux réplication virale persiste à bas bruit et n’est pas détectée évolution des séquences génétiques dans les réservoirs cellulaires

PATHOGENESE (1) Réplication virale continue dans les tissus lymphoides d ’un virus hautement variable qui s ’adapte aux conditions extérieures Mécanismes de destruction des lymphocytes CD4 : mal connu, origine multifactorielle lyse directe des cellules infectées par effet cytopathogène direct du virus lyse des CD4 par les lymphocytes CD8 cytotoxiques non infectés porteurs de glycoprotéines d ’enveloppe virale à leur surface apoptose par stimulation antigénique de cellules ayant été au contact d ’antigènes du virus hyperstimulation cellulaire entrainant une anergie cellulaire

PATHOGENESE (2) Après exposition au virus : 4 phases Primo-infection: pic de réplication virale ARN et CD8 hauts, CD 4 bas Diminution spontanée du titre ARN réponse cytotoxique Phase de latence clinique réplication virale continue mais stable accumulation de virus et détérioration anatomique et fonctionnelle des tissus lymphoides Phase tardive : SIDA ARN haut et CD4 bas

Dynamique de la réplication du VIH-1 production quotidienne de virus : 10x109 virus demi vie du virus plasmatique : 6 heures destruction quotidienne des lymphocytes 10x109 CD4

Primo-infection VIH Etudes chez le singe (infection intravaginale) 1ère cellules cibles : cellules de Langerhans cellules dendritiques de l’épithélium cervico-vaginal fusion avec cellules CD4+ invasion des tissus profonds J2 post infection : virus détecté dans les ganglions lymphatiques iliaques dissémination systémique J5 post infection : culture plasma positive

Primo-infection VIH Chez l’homme : délai entre infection (muqueuse) et virémie initiale : 4 à 11 jours. importance lésions et inflammation de la barrière muqueuse après infection : rapide augmentation de la virémie plasmatique dissémination du virus dans les organes lymphoïdes

PATHOGENESE (3) Patients non progresseurs à long terme : 5% faible charge virale circulante et ganglionnaires CD4 relativement stable préservation de la réponse immunitaire spécifique à médiation cellulaire Patients progresseurs rapides :5 à 10%

PATHOGENESE (4) Facteurs de risque de progression de la maladie Hôte certains haplotypes HLA classe I mutations gènes codant pour les co-récepteurs taux de beta-chimiokines secrétées qualité de la réponse cytotoxique primaire persistance de la réponse spécifique CD4 anti VIH état d ’activation des CD8 Virus tropisme taille de l ’inoculum étendue de la réplication virale délétion au niveau de gènes viraux

Les passages inter-espèces des lentivirus des primates

Diversité des VIH Erreur de la RT: dépourvue de système de réparation 1 erreur par cycle de réplication (1 erreur pour 10 000 bases) Dynamique importante de la réplication virale 10 milliards de virus produits /jour Recombinaisons multiples Toute population virale est une quasi-espèce comportant une multitude de variants

Définition d’un sous type 2 isolats , au moins, entièrement séquencés sans ressemblance avec sous-types connus sans lien épidémiologique divergence env : 20-30% gag : 15%

Classification des VIH Séquence nucléotidique Comparaison des séquences évaluation des distances génétiques fréquence des mutations synonymes et non synonymes Phylogénie moléculaire métode du plus proche voisin méthode de parcimonie méthode du maximum de vraisemblance

Classification des VIH-1 1985-1990 : origine géographique des souches 1992 : 5 sous-types (env : A-->E) (Myers 1992) 1994 : VIH1 groupe M et groupe O (Charneau, 19994) 8 sous types de VIH-1 groupe M 1998 : VIH-1 groupe N (Simon, 1998) 10 sous types de VIH-1 groupe M (A-->J)

Genetic Diversity of HIV-1    - HIV-1 : 3 groups M, N, O  group M (major) 9 subtypes: A B C D F G H J K Nucleotide diversity in pol  10-15% Sub-subtypes: A1-A2, F1-F2, B-D 16 CRFs (Circulating Recombinant Forms) CRF01_AE = Southeast Asia CRF02_AG = West Africa CRF03_AB, CRF04_cpx …  groups O (outlier) and N (non-M/non-O) low prevalence (West Central Africa)

Worldwide the majority of HIV-1 are non-subtype B viruses Eastern Europe A, A/B, B, C Western Europe B A/G, C, G North and Central America China B’/C, A/E Southeast Asia South Asia Africa A/E, B C, B C A/G, A, G A,A/G,C,D,F1,F2, G,H,J,K,A/E,O,N A, D South America F1, B/F, C Australia Recent studies have shown the increasing spreading of recombinant viruses

Mosaic structures of HIV-1: Circulating Recombinant Forms (CRFs) CRF01_AE CRF10_CD CRF02_AG CRF11_cpx CRF03_AB CRF12_BF CRF04_cpx CRF13_cpx CRF05_DF CRF14_BG CRF06_cpx CRF15_AEB CRF07_BC CRF16_A2D CRF08_BC A B C D E F G H J K U B A2 CRF01_AE

Diversité des VIH-1 : conséquences Transmission : ? A/E Pathogénicité : ?? C et D > A (Kanki 1999) A = D (Aleus, 1999) Diagnostic et suivi sérologie quantification de la charge virale Thérapeutique : Résistance aux ARV Vaccin ?

VIH-1 groupe O 30 cas identifiés à ce jour en France et près de 300 au Cameroun Epicentre de l ’épidémie : Cameroun Grande diversité : 4 clades identifiées Parfois mal reconnu au dépistage : faible réactivité des EIA et WB indéterminé non quantifié par les trousses commerciales de charges virales excepté LCX Abbott généralement résistant aux NNRTI

VIH-1 groupe N Nouveau variant décrit en 1998 proche de SIV-cpz-Gab rares cas rapportés à ce jour étude de l ’extension épidémiologique en cours au Cameroun et au Gabon

REPRESENTATION PHYLOGENETIQUE DES VIH ET SIV

Diagnostic de l’infection VIH 1- Adulte : sérologie (dépistage puis confirmation) sauf dans le cas de la primo-infection (ARN viral + Acs), ou de variants. 2- Nouveau né : Mise en évidence (du virus) et/ou de l ’ADN proviral dans les lymphocytes ou de l ’ARN plasmatique.

Dépistage des anticorps anti-VIH Nécessite obligatoirement, pour chaque sérum, 2 techniques ou 2 réactifs différents: soit 2 réactifs ELISA Mixtes, soit 1 réactif ELISA Mixte et un réactif HIV-1 monospécifique, Soit 1 réactif ELISA Mixte et un test unitaire rapide. Direction Générale de la Santé (08 septembre 1993)

Tests de dépistage des Anticorps anti-VIH 1985 Lysats de cellules infectées par VIH-1 Faux négatifs, et spécificité médiocre 1986 Antigènes recombinants et peptides de synthèse 1987 Tests mixtes de détection des anticorps anti-VIH1 et VIH2 1991 Tests sandwich : - Sensibilité +++ - Spécificité +++ 1997 Tests combinés détectant: Acs anti-VIH1, Acs anti-VIH2 et Ag p24.

Enzyme immunoassay (EIA) Enzyme linked immunoassay (ELISA) [Traité de virologie médicale, Huraux, Agut, Nicolas, Peigue-Lafeuille]

ELISA

Microplaque ELISA (rangées sécables)

Dépistage combiné : Ac + Ag (Vidas : HIV Duo)

Caractérisques et évolution des tests ELISA 1ère gen 2nd gen 3ème gen 4ème gen Antigène utilisé protéines et peptides recombinants Lysat viral Elisa indirect indirect sandwich indirect Détection IgG IgG IgG IgM Anticorps Ag P24 Sensibilité + ++ +++ ++++ Spécificité + +++ Année 1985 1987 1989 1997

Tests unitaires rapides de détection des anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2 Ne nécessitent pas « d’équipements » de laboratoire 10-20 mn Lecture visuelle Sensibilité « légèrement » inférieure aux nouvelles techniques Elisa (séro-conversions) Aide au diagnostic d’urgence et en situation de détresse materielle. France : en association obligatoire avec les tests Elisa

Test rapide

DES ANTICORPS ANTI-VIH-1 ET VIH-2 TESTS DE DÉPISTAGE DES ANTICORPS ANTI-VIH-1 ET VIH-2 Agrément par l’Agence du Médicament : sensibilité - panels locaux et commerciaux de séroconversions VIH-1 (50) - VIH-1 groupe M sous types (­ 150) - VIH-2 (­ 50) - VIH-O (­ 10) Spécificité: 2000 sérums Réévaluation périodique des tests par ADM Contrôle de qualité des laboratoires, obligatoire, tous les 6 mois.

Algorithme sérologique Prélèvement n°1 Dépistage (2 tests) –/– +/+ ou +/– Absence d’infection en l’absence d’exposition de moins de 3 mois Prélèvement n°2 WB ou IB VIH1 Positif Négatif ou indéterminé Infection à VIH • Infection récente ? Ag p24 ou Différenciation ARN VIH au mieux VIH-1 - VIH-2 • VIH2 ? ® WB VIH2 • Faux positif ? 3è prélèv . • Erreur tube ? 3è prélèv . • Variant ? Tests spécialisés

Différenciation Acs VIH1 / VIH2 La différenciation entre Acs anti VIH-1 et VIH-2 n’est pas une obligation légale Recommandée par le groupe ANAES (janvier 2000) Peptides synthétiques spécifiques de chacun des 2 virus

Tests de confirmation: WB ou Immunoblot Utilise des tests VIH-1 en première intention Confirme une séropositivité VIH-1 permet de « soupçonner » une primo-infection VIH-1 voire une séropositivité VIH-2, une infection par VIH1 groupe O.

Western Blot ou Immunoblot (HIV confirmation)

Recommended WB nomenclature of major genes and gene products of HIV1 GENE GENE PRODUCTS DESCRIPTION ENV gp 160 Precursor gp gp 120 External gp gp 41 Transmembrane gp GAG p 55 Precursor p 40 Precursor p 24 Core p 17 Matrix POL p 66 Reverse Transcriptase p 51 Reverse Transcriptase p 32 Reverse endonuclease OTHER p 160 GAG/POL precursor WHO, april 1990

Critères pour l’interprétation des Western Blots Organisation Critères Positivité (au minimum) Négativité Organisation Mondiale de la Santé 2 bandes env Aucune bande Centers for Disease Control 2 bandes parmi les: p24, gp41, gp120/160 Aucune bande Consortium pour la standardisation 1 bande p24 ou p32 et Aucune bande de la Sérologie des Rétrovirus 1 bande gp41 ou gp120/160 Croix-Rouge Américaine Au moins une bande de Aucune bande gag, pol et env Food & Drug Administration p24, p32, et gp41 ou gp120 Aucune bande Les profils ne remplissant ni les critères de positivité ni les critères de négativité sont considérés comme « Indéterminés ».

WB ou Immunoblot VIH-1 indéterminé? 1 Séroconversion VIH-1? 2 Infection par VIH-2? 3 Erreur de tube? 4 Variant?

Detection limit of the markers Kinetics of viral markers during primary HIV-1 infection anti gp 160 gp 120 gp 41 set point Detection limit of the markers exposure 11-12 14-15 20-21 28-29 Time (days) PLASMA HIV RNA p24 AG PROVIRAL DNA ANTI-HIV ANTIBODY : ELISA SEROLOGICAL WINDOW PERIOD ANTI-HIV ANTIBODY : WB

 Sérologie VIH ! Titres « faibles » d ’ARN viral (< 105 c/ml) Un Elisa positif faible, WB négatif nécessite un 2ème prélèvement : Elisa, WB, ARN viral Si suspicion clinique de primo-infection : prescription ARN viral plasmatique d’emblée ! Titres « faibles » d ’ARN viral (< 105 c/ml) 

Les infections par VIH-2 L’épidémie VIH-2 est virtuellement restreinte à l’Ouest Africain Lien épidémiologique avec l’Afrique de l’Ouest des cas importés Histoire naturelle différente de l’infection VIH-1 - plus longue incubation - moindre transmissibilité La prévalence des anticorps augmente avec l’âge Mise en place d’une cohorte nationale en France

Le diagnostic sérologique des infections par VIH-2 La réactivité croisée par WB est un problème pour confirmer ou infirmer une infection par VIH-2. Une stratégie utilisant des protéines spécifiques VIH-1 ou VIH-2 avec des tests évitant la réactivité croisée est nécessaire.

Doubles séropositifs VIH-1 et VIH-2 Double réactivité sur les WB VHI-1 et VIH-2 Double réactivité sur les peptides synthétiques VIH-1 et VIH-2 Double infection ou réaction sérologique croisée ? PCR VIH-1 et PCR VIH-2

Diagnostic précoce de l’infection chez l’enfant Transmission mère-enfant en fin de grossesse (35%) ou à l ’accouchement (65%) Lorsque la femme enceinte n’était pas déjà traitée par des antirétroviraux: prophylaxie antirétrovirale au début du 3ième trimestre (28 semaines), associée à une césarienne programmée et au traitement de l’enfant pendant 6 semaines. En l ’absence de prévention VIH-1: 20-35% VIH-2: 3-4% Transmission actuelle en France: 1 à 2%: 10 à 20 NN par an en France. Facteurs prédictifs: statut VIH maternel: clinique, CD4, CV Facteurs obstétricaux: infections cervico-vaginales, rupture prématurée des membranes, chorio-amniotite maternelle allaitement maternel: 15% TME

Diagnostic précoce de l’infection chez l’enfant Prélèvements de l ’enfant : première semaine de vie, 1 mois, 2 mois, 3 mois et 6 mois Techniques Isolement de virus à partir des lymphocytes reste interessant si variant: vérification de la souche de la mère au cours de grossesse pour vérifier que les techniques de Biologie moléculaire sont adaptées+++++ ADN proviral ou ARN plasmatique Deux examens successifs positifs ( selon calendrier prévu)  ARN viral négatif avant l ’âge de 3-6 mois en cas de traitement  surveillance prolongée si allaitement (jusqu’à 3 mois après l’arrêt) 

MESURE DE L’ARN VIH-1 PLASMATIQUE

Charge virale VIH-1 associé à la progression de l’infection à VIH-1 Etude de Mellors (Ann.Int.Med 1997) 1604 patients cohorte MACS évaluation de la valeur pronostique de la charge virale, sur un seul prélèvement à l’entrée dans la cohorte, en comparaison avec les autres marqueurs cliniques et cellulaires analyse rétrospective (bDNA Chiron 2.0) 5 catégories de risque ont été définies en fonction de la valeur de la charge virale charge virale %SIDA à 6 ans %de décès à 6 ans < 500 5,4 0,9 501 - 3000 16,6 6,3 3001 - 10000 31,7 18,1 10001 - 30000 55,2 34,9 > 30000 80 69,5

SEROCO Cohorte à temps de séroconversion connue La valeur prédictive de la charge virale a été établie 4 à 6 mois après la séroconversion ARN VIH-1 SIDA à 6 ans <10 000 10% 10 000 - 30 000 22% >30 000 47% Les CD4 sont également prédictifs de façon indépendante 363 patients avec une seroconversion a date connue entre 1988 et 1995 suivis pendant 6 mois. charge virale faite en roche

CD4+ Count is Better than Plasma HIV-1 RNA in Determining When to Initiate HAART Retrospective review of the risk of a new OI or death based on CD4+ count and viral load at initiation of HAART 1162 patients followed up at Johns Hopkins Median time of therapy - 533 days Viral load prior to initiation of therapy was not associated with risk of disease progression but CD4+ count was: CD4 at HAART Hazard Ratio (95% CI; P value) CD4 < 200 4.3 (2.6, 7.2; P < 0.0001) CD4 201-350 1.6 (0.9, 2.9; P = 0.11) CD4 351-500 1.0 Adapted from T Sterling et al, 8th CROI

Quantification du VIH Développement de techniques de biologie Moléculaire Actuellement: plusieurs tests commerciaux disponibles Enregistrés à l’Agence du Médicament (juillet 96) Cotation à partir du 30 octobre 1997: B 300 Tests disponibles en 2006 Amplification de la cible Cobas amplicor (Roche PCR classique 50 copies/ml) Cobas taqMan HIV-1(Roche PCR temps réel 40 copies/ml) M2000RT (Abbott PCR temps réel 40 c/ml) EasyQ (Biomérieux) Amplification du signal bDNA 2.0 (Bayer) 50c/ml

En pratique (1) Anticoagulant : héparine proscrite. Transport : le délai entre le prélèvement de sang total et le recueil de plasma ne doit pas excéder 3 heures pour Roche, 6 heures pour Chiron et 2 heures pour Nasba. Prise en charge du prélèvement: dès réception, le sang doit être centrifugé et les échantillons de plasma stockés à -80°C. Nombre d’échantillons évaluables par technicien : Roche: 20 / jour (plus avec les techniques automatisées) Chiron : 42 / 2 jours

En pratique Utiliser toujours le même kit pour le même patient. Nécessite une formation pratique et théorique du personnel médico technique. Nécessite une infrastucture adaptée du laboratoire avec différentes zones (extraction, amplification et détection). Contrôle National de Qualité.

CONCLUSION Progrès réalisés dans la compréhension de la pathogénie de l’infection à VIH Beaucoup de questions restent à résoudre : mécanismes de la destruction des lymphocytes CD4 implication de la variabilité génétique du virus dans la pathogénie élaboration d’un vaccin