Pharmacogénétique des antalgiques Xavier Declèves Pharmacie-Pharmacologie-Toxicologie, Hôtel-Dieu INSERM U705, CNRS UMR 7157 Neuropsychopharmacologie des addictions Faculté de Pharmacie Paris Descartes Master 1 Santé Parcours PPT

Rappels de stratégie thérapeutique des antalgiques Master 1 Santé Parcours PPT

Douleur Chronique…. Question de santé publique Europe: 75 M douloureux chroniques France: 7 M (15% de pop > 18 ans) 4% traités par opioïdes forts Douleur liée au cancer:3% des patients Fort impact sur la qualité de vie Master 1 Santé Parcours PPT Etude européenne EFIC 2003

Douleur chronique et traitement 34% des douloureux sans traitement 20% n’ont jamais pris de traitement 50% ont des traitements ciblés 19% opioïdes faibles 4% opioïdes forts Etude européenne EFIC 2003 Master 1 Santé Parcours PPT

57% des patients atteints d’un cancer sont douloureux* Prévalence 57% des patients atteints d’un cancer sont douloureux* 69% Douleur forte 30% Pas de Traitement 51% Traitement Inadapté Master 1 Santé Parcours PPT * F.Larue, BMJ 1995

Diagnostic Douleur neurogène Douleur nociceptive Altération partielle ou totale du système nerveux périphérique ou central. Douleur nociceptive Excès de stimulation des récepteurs périphériques (traumatismes, infections, agressions chimiques, ischémiques ou inflammatoires). Master 1 Santé Parcours PPT

Caractéristiques de la douleur chronique Pics algiques prévisibles(non comptabilisés dans l’adaptation) imprévisibles (gérés par le patient) Intensité de la douleur Douleur de fond stable dans la durée persistante dans le temps Temps Master 1 Santé Parcours PPT

Règles de l’OMS Voie la plus simple Administration à heures fixes Prescriptions personnalisées Ne négligeant aucun détail Respect des paliers Master 1 Santé Parcours PPT

Douleurs modérées à sévères Douleurs légères à modérées Paliers de l’OMS si échec Opioïdes forts Douleurs sévères Morphine Fentanyl Oxycodone hydromorphone Palier 3 si échec Opioïdes faibles Douleurs modérées à sévères Codéine Dextropropoxyphène Tramadol poudre d’opium Palier 2 Palier1 Non opioïdes Douleurs légères à modérées Salicylés AINS Paracétamol Acupan Master 1 Santé Parcours PPT

Morphiniques disponibles en France Date de mise sur le marché: 1986 : Morphine LP 1997 : Fentanyl transdermique 1998 : Hydromorphone LP 1999 : Morphine LI 2000 : Oxycodone LP OMS 1997 : la morphine est le traitement de référence des douleurs modérées à sévères liées au cancer Master 1 Santé Parcours PPT

Palier 3: indications Douleur nociceptive modérée à intense Rotation des opioïdes Douleur neurogène Master 1 Santé Parcours PPT

Pourquoi s’intéresser à la pharmacogénétique des opioïdes ? Master 1 Santé Parcours PPT

Relation toxicocinétique - toxicodynamique Master 1 Santé Parcours PPT

Facteurs de variabilité d’ordre pharmacogénétique des opioïdes INTESTIN SNC SANG PK PD CYP450 UGT2B7 SANG Master 1 Santé Parcours PPT Transport et Métabolisme Cible

Pourquoi s’intéresser également à la pharmacogénétique des cibles pharmacocinétiques des antalgiques opioïdes ? Médicament Transport Métabolisme Métabolites Métabolite actif Morphine P-glycoprotéine UGT2B7 M6G, M3G oui (M6G) Codéine CYP2D6 oui Méthadone CYP3A4 EDDP non Fentanyl Norfentanyl Tramadol M1, M2 oui (M1) Oxycodone oxymorphone NB: En rouge figurent les protéines présentant des SNP fonctionnels Master 1 Santé Parcours PPT

Pharmacocogénétique des antalgiques de palier 2

Métabolisme de la codéine Master 1 Santé Parcours PPT

POLYMORPHISME GENETIQUE CYP 2D6 METABOLISEURS RAPIDES CAUCASIENS: 85-90 % METABOLISEURS LENTS CAUCASIENS: 7-10 % METABOLISEURS ULTRA RAPIDES CAUCASIENS: 1-7 % Metabolic ratio (log) Debrisoquine 4 OH-Debrisoquine Master 1 Santé Parcours PPT D’après F. P. Guengerich, mol. interv., 2003

SUBSTRATS DU CYP 2D6 Oxycodone Antiarrythmics Antidepressants Beta-blockers Neuroleptics Miscellaneous Amiodarone Imipramine Propranolol Perphenazine Codeine Encainide Desipramine Timolol Thioridazine Debrisoquine Flecainide Amitriptyline Bufuralol Indoramin Mexilitine Nortriptyline Metoprolol Phenformin N-propylamaline Clomipramine Ecstasy Propafenone Tramadol Sparteine Oxycodone Master 1 Santé Parcours PPT

CONSEQUENCES CLINIQUES DU POLYMORPHISME CYP 2D6 CODEINE CODEINE- 6- GLUCURONIDE CYP 3A4 10% CYP 2D6 (MR) NORCODEINE MORPHINE UGT2B7 MORPHINE 3- et 6- GLUCURONIDES CODEINE CODEINE - 6- GLUCURONIDE NORCODEINE CYP 3A4 SI METABOLISEUR LENT Phénotype sans composante analgésique CYP 2D6 (MR) CODEINE CODEINE- 6- GLUCURONIDE NORCODEINE CYP 3A4 SI METABOLISEUR ULTRA-RAPIDE Phénotype avec hyperproduction de morphine Master 1 Santé Parcours PPT

Histoire de la maladie Homme 62 ans LLC Pneumonie bilatérale, fièvre, toux J1: Ceftriaxone, voriconazole, clarithromycine, codéine (25 mg x 3/j) J4: détérioration conscience (glasgow 6), myosis Naloxone 0.4mg/h: conscience normale Biologie Créatininémie: 182 µM Dosage médicaments: Codéine 114 µg/L (N: 13-75) Morphine 80 µg/L (N: 1-4) M6G 136 µg/L (N: 1-13) Génotypage: CYP2D6 ultra-rapide Master 1 Santé Parcours PPT Gasche et al, NEJM 2004

Intoxication grave chez un nouveau né Histoire de la maladie Grossesse normale, Nouveau né RAS, Allaitement de la mère Douleur post partum : Codéine 120 mg/j Paracétamol 500 mg/j J7 léthargie, diminution prise de lait J11: hospitalisation réa pédiatrique J13: cyanose, mort Médecine légale: Aucune maladie congénitale Analyse toxicologique: Sang Morphine sang 70 µg/L (N: 10-12) Paracetamol sang : 5.9 µg/L Mère Génotypage Hétérozygote CYP2D6*2x2 (UR) UGT2B7*2: UR Master 1 Santé Parcours PPT Koren et al, The Lancet 2007

Métabolisme du tramadol CYP2D6,…. CYP3A4,…. Activité opioïde +++ Activité sérotoninergique +++ Master 1 Santé Parcours PPT Subrahmanyam et al, 2001

Pharmacogénétique du tramadol Master 1 Santé Parcours PPT Stamer et al, Pain 2003

Modification du profil d’analgésie: rapport M1/M2

Métabolisme de l’oxycodone Actif +++ Peu actif

Métabolisme de l’oxycodone

Métabolisme de l’oxycodone CYP2D6 O-demethylation CYP3A4/CYP3A5 N-demethylation Actif +++ Peu actif

Antalgiques de palier 3

Structure génomique chez l’homme du récepteur Mu des opioïdes 1994: MOR1A 1999: 4 exons MOR1 et MOR1A 6 SNP Promoter/enhancer régions (Uhl et al. PNAS 1999)

Structure génomique chez l’homme 2002 : Chr 6q24-25, 90kb 4 exons et 3 introns (Xin et al. AAPS PharmSci. 2002)

N-Term Exon 1 : 290 bp Exon 3 ][ C-Term Exon 2 : 353pb Exon 4 97 AAs Intron 2 : 773pb N-Term Exon 1 : 290 bp 97 AAs Exon 3 Extracellulaire ][ 174 AAs C-Term Intracellulaire 118 AAs 12 AAs Exon 2 : 353pb Exon 4 Intron 1 : 50kb Intron 3 : 27kb

2005 (Pan et al. Neuroscience. 2005) Cellules de neuroblastome 2003, Exon 7 2003, Exon 15, trouvé dans le cerveau Existerait un exon 18 donnant des récepteurs ressemblants à MOR1V de la souris? Pas d’exon 8, 9 et 19 (Pan et al. Neuroscience. 2005) Cellules de neuroblastome 2003: 2 nouveux ex O et X Ex7 souris=exO homme Pas d’homologue humain des ex 8 et 9 de la souris Cellules de neuroblastome Existe un mMOR1 variant avec 7 pas 8 ni 9 comme hMOR1O (non publié) Un partiel ex X; cerveau; 60%homologies avec ex 7 souris; pas de variant souris homologue Version humaine de l’ex5 de la souris (non publié) (Pan et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003) (Pan et al. DNA Cell Biology 2005) Protéine ressemble mMOR1G (6TM) (Pan et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003)

Les polymorphismes

Le polymorphisme c.A118G Asn40Asp : suppression d’un site de N-glycosylation dans la partie extracellulaire du récepteur (conformation permettant transport du récepteur vers la membrane) mais pas de changement dans la structure tertiaire (Bond et al. PNAS 1998; Bergen et al. Mol. Psychiatry 1997) Pas de différence d’affinité mais expression réduite de l’ARNm et de la protéine issue de l’allèle muté dans les cellules HEK293 ou CHO mais pas problème de stabilité de l’ARNm (Beyer et al. J. Neurochem. 2004, Zhang et al. J. Biol. Chem. 2005) 2 autres études ne retrouvent pas ces résultats mais travaillent sur d’autres cellules Une autre rapporte une augmentation de 1.5 fois de l’affinité

Le RÉCEPTEUR µ DES OPIOIDES Gène OPRM1 SNP: A118G Fréquence allélique: 10-15% Asn40Asp Suppression d’un site de N-glycosylation 118GG : efficacité (expression ?) moindre du récepteur Master 1 Santé Parcours PPT

Génotypage A118G du récepteur Mu Le SNP A118G du gène OPRM1 (récepteur µ) influence la dose efficace de morphine (Reyes et al, Pain 2006) Cohorte de 207 patients Morphine 3 jours dose stable, soins palliatifs cancer Génotypage A118G du récepteur Mu AA (n = 166) 112 AG (n = 36) 132 GG (n = 5) 216 Dose de morphine (mg) Master 1 Santé Parcours PPT

Reyes et al, Pain 2006 207 patients SNP récepteur Mu (A118G) Morphine 3 jours dose stable, soins palliatifs cancer SNP récepteur Mu (A118G) dose morphine AA (n = 166) 112 96; 128 3 3.60 (2.6) AG (n = 36) 132 76; 187 4 4.10 (1.8) GG (n = 5) 216 60; 371 2 2.0 (1.2) Master 1 Santé Parcours PPT

Janicki et al, Anesth Analg 2006 Patients Douleur chronique cancer : n=121 Douleur aigue post op : n=101 SNP récepteur Mu (A118G) Pas association génotype et douleur post op ou dose morphine Master 1 Santé Parcours PPT

Chou et al, Acta anaesthesiol Scand 2006 Patients Post op douleur arthroplastie du genou : n=147 SNP récepteur Mu (A118G) GG (n=13) : dose morphine 40.4 mg pendant 48h post op AA (n= 74) : dose morphine 25.3 mg AG (n= 33) : dose morphine 25.6 mg Master 1 Santé Parcours PPT

Chou et al, anesthesiology 2006 Patients Femme hystérectomie : n=80 Master 1 Santé Parcours PPT

Coulbault et al, Clin Pharmacol Ther 2006 Patients Chirurgie colorectale : n=74 SNP récepteur Mu (A118G) GG (n=2) : dose morphine 58.5 mg/24h AA (n= 57) : dose morphine 49.9 mh/24h (NS) SNP P-glycoprotéine (C3435T) Pas d’association avec dose morphine Master 1 Santé Parcours PPT

Lotsch et al, Anesthesiology 2002 2 patients âgés, douleur chronique, IR Patient 1: M6G: 1735 nM Tolérance morphine excellente SNP 118AA Patient 2: M6G: 941 nM Tolérance morphine mauvaise (somnolence, engourdissement) SNP 118GG Master 1 Santé Parcours PPT

La COMT: Catechol-O-MethylTransferase SNP: Val158Met Activité enzymatique Met/Met 3 fois plus faible que Val/Val Fréquence allélique : 45 % Master 1 Santé Parcours PPT

Au niveau central: Emotions, douleur et génétique Les homozygotes pour l’allèle met158 montrent: diminution de la réponse opioïde  à la douleur vs homozygotes val158. taux plus élevés de composante sensorielle, affective et un état négatif plus élevé. met158 val158 Etat basal Forme active de COMT: val158. Réduit l’activité de la dopamine, augmente l’activité des moins de douleur et de comportement douloureux Réponse à la douleur Master 1 Santé Parcours PPT Zubieta et coll, Science 2003

207 patients caucasiens présentant une douleur cancéreuse La mutation Met158Val influence la dose efficace de morphine (Rakvag et al, Pain 2007) 207 patients caucasiens présentant une douleur cancéreuse Master 1 Santé Parcours PPT

LES PROTEINES MEMBRANAIRES DE TRANSPORT « 15% des gènes humains codent 4500 protéines de transport » Paulsen, FEBS Lett., 1998 ; J. Mol. Biol., 1998 ATP-Binding Cassette (ABC) Major Facilitator Superfamilly (MFS) Solute Carrier (SLC) 50 % Master 1 Santé Parcours PPT

La super famille des protéines ABC 49 transporteurs ATP – Binding Cassette chez l’Homme Noms ABC1 MDR P-gp MRP ALD OABP GCN20 White BCRP Sous-familles ABCA ABCB ABCC ABCD ABCE ABCF ABCG Membres 12 11 13 4 1 3 5 (+1?) 1ère époque : cancérologie (1970 - ) Phénomène MDR (Multi Drug Resistance) MDR1, P-glycoprotéine, ABCB1 Mdr1a et Mdr1b chez les rongeurs cavéoline 2 ème époque : pharmacologie (1990-) Expression tissus sains (Protection et Détoxication) Master 1 Santé Parcours PPT

La P-GLYCOPROTÉINE INTESTIN SANG CERVEAU Transporteur d’efflux: ABC transporteurs Gène MDR1 (ABCB1) SNP: C3435T Fréquence allélique 45%  expression P-gp (Hoffmeyer et al, PNAS 2000) SANG Master 1 Santé Parcours PPT CERVEAU

Mécanismes d' efflux de la P-gp From Romsicki and Sharom, 1999 Flippase activity D D 3 mécanismes : Pore aqueux Aspirateur (Vacuum cleaner) Translocation (Flippase) D D D Master 1 Santé Parcours PPT

Quelques substrats de la P-glycoprotéine Anti-cancéreux Doxorubicine, taxoïdes Vincristine, vinblastine Cardio-vasculaire Digoxine Quinidine Anti-protéases Indinavir Nelfinavir Saquinavir Anti-diarrhéiques Lopéramide Antibiotiques Erythromycine Immunosuppresseurs Cyclosporine Stéroïdes Dexaméthasone Inhibiteurs calciques Vérapamil Antagonistes adrénergiques Talinolol Anti-histaminiques H1 fexofénadine Anti-histaminiques H2 Cimétidine Anti-dépresseurs Amitriptyline Antalgiques Morphine Oxycodone Méthadone Master 1 Santé Parcours PPT

Les SNP 3435T (ABCB1) ou 118A (OPRM1) prédisposent à une meilleure activité analgésique de la morphine (Campa et al, CPT 2008) ABCB1 3435T: Expression (ou activité?) de la P-gp plus faible donc plus de morphine dans le sang et le cerveau OPRM1 118A: récepteur Mu plus efficace donc activité morphine plus forte Hypothèse: Analgésie plus forte pour les 3435TT et 118AA ? Master 1 Santé Parcours PPT

L’haplotype 3435T (ABCB1) et 118A (OPRM1) prédisposent à une meilleure activité analgésique de la morphine (Campa et al, CPT 2008) Master 1 Santé Parcours PPT

Méthodologie recherche SNP Prélèvement: 5ml de sang EDTA Extraction ADNg et dosage ADN PCR: amplification région spécifique Séquençage direct Digestion enzymatique : PCR-RFLP PCR quantitative et courbe de fusion Master 1 Santé Parcours PPT

PCR Master 1 Santé Parcours PPT

Amplification par PCR Master 1 Santé Parcours PPT

Méthodologie Hôtel Dieu (ROCHE, Light Cylcler) Sondes pour la détection de mutation perfect match mismatch Titre : Utilisation du Tm des sondes d‘hybridation pour rechercher une mutation ponctuelle. Contenu : But : Insister sur la possibilité unique proposée par l‘utilisation des sondes d‘hybridation dans la recherche de mutation. Explication classique. Comment on détecte une mutation ponctuelle sur le LightCycler system. Sonde d‘ancrage Sonde de mutation Le Tm de la sonde de mutation est environ 5 °C plus bas que le Tm de la sonde d‘ancrage Master 1 Santé Parcours PPT

Application: détection de mutation Perfect match Mismatch Température basse moyenne élevée Master 1 Santé Parcours PPT

Génotypage par courbe de fusion Mutation ponctuelle (Facteur V Leiden) Homozygote sauvage Homozygote mutant Hétérozygote muté Master 1 Santé Parcours PPT

CC CT TT Courbe de fusion SNP C3435T Light Cycler Master 1 Santé Parcours PPT 3

génétique & antalgiques CONCLUSIONS POUR LE CLINICIEN : Intérêt dans la physiopathologie de la douleur : dans la prédisposition à développer un syndrome douloureux chronique Intérêt en clinique: Efficacité thérapeutique Interactions médicamenteuses : +++ le plus avancé Développement d’effets secondaires Développement d’abus médicamenteux voire d’addictions Un domaine en plein essor Pour une pratique courante en antalgie ? Limites de prédictivité

Conclusions Développement des tests de pharmacogénétique des antalgiques au sein de METHEO Validés: CYP2D6 MDR1: C3435T, G2677T/A OPRM1: A118G COMT: Met158Val En cours : UGT2B7, MRP2, Kappa, Delta… Nécessité de mettre en place des études de pharmacogénétique pour les antalgiques Oxycodone, tramadol, méthadone Effets antalgiques et secondaires Ne pas oublier la pharmacocinétique…