Les examens biologiques en Hématologie Rémi Letestu Laboratoire d’Hématologie CHU Avicenne UFR SMBH DCEM1 (2006-07)

Progéniteurs lymphoïdes Hématopoïèse Cellules souches Progéniteurs lymphoïdes CFU-GEMM MOELLE OSSEUSE BFU-E CFU-E Tpo réticulocytes mégacaryocytes SANG plaquettes monocytes éosinophiles T érythrocytes B neutrophiles basophiles lymphocytes macrophages

Les différents examens SANG NFS ou hémogramme Frottis sanguin MOELLE OSSEUSE Myélogramme Biopsie médullaire GANGLION (adénopathie) Ponction gg Biopsie gg BIOPSIES Chirurgicales ou à l’aiguille

Les différentes techniques CYTOMETRIE EN FLUX ou IMMUNOPHENOTYPAGE CYTOLOGIE Cytochimie CYTOGENETIQUE HISTOLOGIE ou ANATOMO-PATHOLOGIE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Hémogramme ou NFS Définition: analyse quantitative et qualitative des éléments figurés du sang Décompte des GR, GB, et plaquettes par unité de vol de sang (numération) Décompte des ≠ sous-types de GB (formule sanguine) Analyse morphologique de ces éléments

La Numération Formule Sanguine (NFS) Ponction de sang veineux Prélèvement sur anticoagulant : EDTA Compteurs Automatiques : importance des contrôles ++

Valeurs Normales de l ’Hémogramme La Numération Globules Blancs : 4-10x109/L 4-15x109/L Plaquettes : 150-450 x109/L 20 x109/L Globules Rouges H : 4.5-6.2 x1012/L F : 4-5.4 x1012/L E : 3.6-5 x1012/L NRS : 5-6 x1012/L Hémoglobine (Hb) H : 13-18 g/dL F : 12-16 g/dL E : 12-16 g/dL NRS : 14-20 g/dL Hématocrite H : 40-54% F : 35-47% E : 36-44% NRS : 44-62%

Valeurs Normales de l ’Hémogramme Les Réticulocytes Automates / Coloration sur lame (/1000 GR) Environ 1-/120° des GR Expression en valeur absolue 25000 à 100000 quand Hb Normale La Formule Polynucléaires Neutrophiles : 1.7-7x109/L Polynucléaires Eosinophiles : 0-0.5x109/L Polynucléaires Basophiles : 0-0.05x109/L Lymphocytes : 1.5-4x109/L Monocytes : 0.1-1x109/L

Valeurs Normales de l ’Hémogramme Les constantes de Wintrobe Volume Globulaire Moyen (VGM) 85-95 fl (83-97) Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb (CCMH) 32-36% Teneur Corpusculaire Moyenne en Hb (TCMH) 27-32 pg/cellule

Frottis sanguin Technique Étalement d’une goutte de sang sur une lame Coloration May-Grünwald-Giemsa (MGG) Analyse au microscope Indications Diagnostic d’anomalies morphologiques Des GR Des GB Des plaquettes Recherche et identification de cellules anormales myélémie, blastes cellules lymphomateuses Vérification du nombre de plaquettes++

Quand prescrire un Hémogramme en urgence Etat de choc Pâleur intense, asthénie, Angine ulcéro-nécrotique ou résistante aux antibiotiques Fièvre élevée après prise de médicament, surtout après chimiothérapie anti-mitotique Fièvre résistante aux antibiotiques Purpura pétéchial, syndrome hémorragique

Valeurs de l’hémogramme indiquant une consultation spécialisée en urgence Hématocrite supérieur à 60 % Anémie inférieure à 7 g/dl ou mal tolérée Neutropénie inférieure à 200/mm3 (0.2 G/L) Hyperleucocytose faite de cellules immatures supérieure à 20 000/mm3 Thrombopénie inférieure à 20 000/mm3 (20 G/L) même sans syndrome hémorragique Après élimination d’une fausse thrombopénie à l’EDTA

Le Myélogramme Anémies normo ou macrocytaires arégénératives Historique 1920-1927 Arinkin -1935 Mallarmé Ponction Sternale / Iliaque Post > Antérieure Indications Nombreuses : toute suspicion d’anomalie centrale de production des éléments du sang Anémies normo ou macrocytaires arégénératives et/ou Neutropénies et/ou Thrombopénie Pancytopénie Pic monoclonal Diagnostic Analyses spécialisées Contre-indications Très rares - Enfant - Contre indication sternale Troubles graves de la coagulation

Le Myélogramme Trocart de type Mallarmé Trocarts de type Jamshidi Précautions Indispensables Chez l ’enfant Formation au geste Règles strictes Déroulement du geste Anesthésie locale Ponction Réalisation des frottis : point essentiel Trocart de type Mallarmé Trocarts de type Jamshidi

Le Myélogramme Quantité & Qualité de la Moelle Osseuse Cellules à l ’origine des éléments circulants Exploration des lignées Myéloïde et Lymphoïde

La lignée granuleuse neutrophile MB Myéloblaste PML Promyélocyte MLN Myélocyte neutrophile MMLN Métamyélocyte PN Polynucléaire neutrophile

La lignée érythroblastique PROER Proérythroblaste La lignée érythroblastique ERB Érythroblaste basophile ERP Érythroblaste polychromatophile ERA Érythroblaste acidophile

Facile, non douloureux, informatif ++ L ’Adénogramme Organe lymphoïde Exploration des lignées Lymphoïdes Ponction aiguille Frottis Facile, non douloureux, informatif ++

Les Biopsies Chirurgicales A l’aiguille Masse tumorale (lymphomes) Ganglion : La biopsie ganglionnaire A l’aiguille Sous Scanner La Biopsie Ostéo-Médullaire (BOM)

La biopsie ganglionnaire Prélèvement ganglion entier par technique chirurgicale Morphologie, coupes histologique Immunomarquages sur lame immunocytochimie Suspension de cellules

La biopsie ostéomédullaire (BOM) Historique 1920-1927 Arinkin 1950 développement Ponction Iliaque Post Indications Nombreuses Diagnostic et Bilan d ’extension Analyses spécialisées Contre-indications Rares Troubles graves de la coagulation Thrombopénie sévère, thrombopathie Déroulement du geste

La Cytométrie en Flux Système Fluidique Paramètres Optiques Mélange cellulaire hétérogène et complexe Injection de la suspension cellulaire Liquide de gaine sous pression Etirement de la veine liquide Alignement et passage des cellules une par une dans la chambre d ’analyse Paramètres Optiques Dans la chambre d’analyse : impact avec un faisceau LASER Lumière monochromatique cohérente «Eclairage de la cellules» Taille relative : Forward Scatter ou FSC Complexité cytoplasmique : Side Scatter SSC Excitation des fluorochromes et émission de fluorescence

Paramètres fluorescents Pourquoi la cellule est-elle fluorescente ? Les cellules expriment des marqueurs antigéniques : Protéines Sucres En surface ou en intracytoplasmique Marqueurs classés en CD (Cluster de Differenciation) Sélection d’anticorps reconnaissant spécifiquement ces marqueurs Couplage des anticorps à différents fluorochromes Signaux fluorescents recueillis : Nombre et type de marqueurs exprimés Qualitatif Densité d’expression Quantitatif

Conversion en données numériques Recueil des signaux optiques : Miroirs, filtres, photomultiplicateur Transformation en signaux électroniques pour une analyse informatique avec un logiciel dédié Mise en forme des données Analyse des graphes, positionnement des seuils de positivité et des populations d’intérêt, statistiques

Applications dans un Laboratoire de Recherche Etudes de la fonction Immune Cellules Hématopoïétiques Etudes Multi-drug résistance (cancer) Etudes cinétiques (fonction cellulaire) Analyse des plaquettes Détection des Microorganismes (Bactéries, Parasites) Analyse des échantillons de l’environnement (Giardia, Cryptospiridium) Détection Micro-Particules & Virus

Applications en Biologie Médicale Immunophénotypage Leucémie et Lymphomes Suivi de la maladie résiduelle des hémopathies Immunophénotypage VIH Comptes Absolus CD4 Numération cellules progéniteurs (CD34) Analyse des glycoprotéines plaquettaires Cycle cellulaire et ploïdie de tumeurs Numération des Réticulocytes Cross-Match (transplantation d’organe) Détection des Leucocytes Résiduels

Caryotype Culture Mitoses Classement des chromosomes Cytogénétique Caryotype Culture Mitoses Classement des chromosomes FISH Hybridation in situ de sondes fluorescentes

n Cycles = 2n copies Biologie Moléculaire PCR : Polymerase Chain Reaction Sur ADN Sur ADN complémentaire RT-PCR Séquençage X2 X2 n Cycles = 2n copies X2

RT-PCR quantitative (RQ-PCR) pour le suivi des patients Biologie Moléculaire 14q32 Recherche d’équivalent moléculaire de translocation IgH-Bcl1 et t(11;14) IgH-Bcl2 et t(14;18) Recherche d’expression dérégulée d’un gène Cycline D1 (t(11;14)) Recherche de transcrit de fusion BCR-Abelson et t(9;22) VH DH JH m d g a e PRAD1/BCL1/CCND1 120kb 11q13 D1 D2 D3 RT-PCR quantitative (RQ-PCR) pour le suivi des patients

Culture des progéniteurs hématopoïétiques EEC CFU-E EEC = endogenous erythroid colonies Formation des colonies érythroïdes « spontanées » in vitro

Hyperlymphocytose ou Lymphocytes atypiques Conclusion : Orientation Diagnostique Monotypie douteuse Lymphome T CD19+5- CD19+5+ Score 4-5 Score 1-2-3 Score bas 0-1-2-3 Compléments CMF LLC typique : diagnostic positif Immuno- phénotypique LNH du Manteau SLPC CD5+ (LLC atypique ou autre) LNH Folliculaire LNH Zone marginale L. à Tricholeucocytes SLVL LNH lymphoplasmocytaire L. Prolymphocytaire B (Galton) Cytométrie en Flux Syndrome mononucléosique Hyperlymphocytose ou Lymphocytes atypiques Cytogénétique FISH Anatomie pathologique Biologie Moléculaire Examens spécialisés complémentaires