un marqueur potentiel du risque vasculaire ? HPBP, un marqueur potentiel du risque vasculaire ? IBS (CEA-CNRS-UJF)

Rappels sur le transport des lipides et les maladies cardio-vasculaires

Les lipoprotéines Plusieurs catégories chylomicrons VLDL LDL HDL (Very Low Density Lipoprotein) LDL (Low Density Lipoprotein) HDL (High Density Lipoprotein) alias "bon cholesterol"

Cycle des lipides chylomicron foie intestin VLDL LDL HDL TG CE acide gras acides gras cholestérol Cholestérol triglycérides cellule adipeuse ou muscle triglycérides intestin acide gras TG CE CE VLDL TG cholestérol CE Cellule cholestérol LDL cholestérol HDL

L’athérosclérose 1ere cause de mortalité dans les pays à mode de vie occidentale C’est un dépôt de cholestérol et de phosphate de calcium qui bouche les artères Provoque l’infarctus et la thrombose Le processus est encore mal connu mais implique les LDL oxydées qui sont captées par des macrophages

Découverte de la Human Phosphate Binding Protein (HPBP) Essais de cristallisation de HPON1 à partir de lots HPON1 "purs"  Plasmas fournis par le CTS Structure de HPON chimérique Harel et al., Nat. Struct Biol (2004) Structure de HPBP R.Morales et al., Structure (2006)

HPBP est copurifiée avec la paraoxonase (HPON1) la paraoxonase (38-45 KDa) : - apoprotéine associée aux HDL - protéine hydrophobe - glycosylée - activité arylesterase et phosphotriesterase - hydrolyse les agents neurotoxiques (soman, sarin ..) - la paraoxonase a un rôle antiathérogénique (Souris knock-out) Rôles physiologiques ?: Activité thiolactone : dégrade l’homocystèine Protège les LDL de l’oxydation …

HPBP est associée avec HPON1 et elles ont la même masse moléculaire Gel bidimensionnel Immunoprécipitation 45kDa 39kDa Seules des conditions drastiques ont permis de séparer HPBP et HPON1 HPBP est associée avec HPON1 et elles ont la même masse moléculaire Échangeur d’anion hydroxyapatite On parvient à les séparer sur hydroxyapatite F. Renault et al., J Chrom B (2006) 45kDa HPON1 39kDa HPBP

Dérivé coloré fournit par ML. Chesne-Seck 2 ponts disulfures phosphate Structure SIRAS à 1.9 Å Dérivé coloré fournit par ML. Chesne-Seck

"Phosphate Solute Binding Proteins" associées aux transporteurs ABC Boucle 2 HPBP E. coli PstS protein M. tuberculosis PstS1 Boucle 3 Boucle 4 Boucle 1 HPBP est similaire aux "Phosphate Solute Binding Proteins" associées aux transporteurs ABC   

Schéma d’un transporteur ABC Ions Peptides … Binding protein HPBP est la première "binding protein" détectée chez un eucaryote

HPBP fixe le phosphate Avec 13 liaisons hydrogènes affinité submicromolaire (32P) - Spécificité entre phosphate et le sulfate (105) HPBP est le premier transporteur de phosphate caractérisé dans le plasma

La paraoxonase “pure” est un mulltimère Josse et al., JBC (2002) Poster M. Elias L’oligomérisation du complexe paraoxonase-HPBP dépend de la concentration de phosphate et de calcium Cela confirme que HPBP est liée au mécanisme phosphocalcique

Localisation physiologique de HPBP sur la plupart des lipoprotéines Dans les cellules de foie et d’intestin

HPBP est une apolipoprotéine hydrophobe Région hydrophobe PON HPBP

HPBP et génome HPBP n’a jamais été caractérisée ni prédite par les banques de données génomiques

Puis vérifiée par spectrométrie de masse MS/MS Séquençage de HPBP Initialement HPBP (378 aa) a été séquencée par cristallographie (10% d’ambigüité) Puis vérifiée par spectrométrie de masse MS/MS (A. Van Dorsselaer). La complémentarité des deux techniques ont permis de séquencer complètement la protéine sans ambigüité.

Attribution à partir de densité

MALDI-MS spectrum of trypsin digest of HPBP

Ambiguities of the crystallographic sequencing Isosteric amino acids Difficult to discriminate C, N, and O at 1.9Å Discrimination using chemical neighborhood Very difficult: attribution not reliable : 50% Possible: attribution reliable: more than 70% Residues with similar electronic density shapes

Il y au moins 3 protéines humaines absentes du génome séquencé Human DING proteins N-terminus: D I N G G G A T L P Q… Les protéines DING sont absentes des banques données Elles sont principalement caractérisée que par leurs extrémités N-term Protein Origin Function Synovial stimulatory protein Fibroblasts T lymphocyte proliferation Etiology of rheumatoid arthritis? Hirudin binding protein (leech thrombin inhibitor) Cell proliferation Genistein binding protein (soybean isoflavone with oestrogen activity) Carcinoma cell culture medium Cell proliferation? Apoptosis? Proteolysis inducing factor receptor Muscles and liver (tumors) Activation of phospholipase A2 : proteasome activation (cachexia) Crystal (Ca oxalate) adhesion inhibitor (CAI) Kidney epithelial cells Inhibition of kidney stone adhesion to epithelial cells Phosphate binding protein (HPBP) Plasma (HDL) Involved in phosphocalcic mechanism ? HPBP est la première DING séquencée complètement Il y au moins 3 protéines humaines absentes du génome séquencé

Les protéines DING semblent ubiquitaires Autres DING protéines Protein Origin Functions Cotinine receptor (nicotine derivative) Rat: neurones Lipid-free polysaccharide- binding protein Turkey: “air sac fluid” Pathogen adhesion to epithelial cells: trigger of defense reactions? Hepatitis Virus binding protein Woodchuck plasma ? Macrophage C3R ligand Candida albicans Aspergillus nidulans C3R ligand : « hijacking » of complement system Germin-Like Protein (GLP) binding protein Tobacco DING protein Hypericum perforatum (St.John’s wort) Inhibits HIV transcription and replication Les protéines DING semblent ubiquitaires chez les eucaryotes

Il existe des fragments de gènes de DING 97% d’identité (sur 628 pb) eucaryotes procaryotes Absence systématique de HPBP des banques de données nucléotidiques. Autre mystère : La très grande conservation des séquences partielles nucléotidiques entre des espèces très différentes.

Les protéines DING sont liées à plusieurs pathologies Références

Rôles possibles de la HPBP Le phosphate est une molécule très importante impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques. HPBP est principalement liée aux lipoprotéine HPBP fixe le phosphate HPBP est associée à HPON1. modulée par l’environnement phosphocalcique HPBP est similaire à la CAI Inhibe la formation des calculs rénaux HPBP peut être impliquée dans les maladies liées à la phosphatémie telle que l’athérosclérose

Mapping des anticorps polyclonaux

Mapping des anticorps monoclonaux Très utile pour dévelloper un ELISA "type sandwich" Etude des cohortes

HPBP et HPON1 un bio-épurateur Essentielle à la stabilité et la fonctionnalité du complexe paraoxonase-HPBP Un enjeu pour la prophylaxie et le traitement des intoxications par les agents neurotoxiques. Paraoxonase : bio-épurateur catalytique. (responsable de la résistance des mammifères face aux insecticides) La butyrylcholinesterase : épurateur stoechiométrique. Production U.S. Army (1 million de dose (200mg) par an) remplacera en 2007 la pyridostigmine. Production par chèvres transgéniques (Nexia). Co-exprimer HPON1 avec HPBP

Conclusions L’étude de cette nouvelle protéine : soulève des questions au niveau génétique de plus, elle pourrait avoir un intérêt au niveau médical (Maladies cardiovasculaires, arthrite, cancer, HIV). L’opportunité de travailler avec une protéine inconnue ouvre un large champs d’investigation, autorisant tous les espoirs.

Remerciements LCCP,IBS, Grenoble: R. Morales, P. Carpentier, J. Dupuis, C. Contreras, J.C. Fontecilla IBMP, Strasbourg: F. Bernier LCM, IBS, Grenoble: M.L. Chesne, R. Kahn, J. Vicat CRSSA Grenoble: D. Rochu, F. Renaud, P. Masson LBA, Nancy: M. Nicodeme LSMBO, Strasbourg: H. dimer, C. Schaefer, A. Van Dorsselaer FIP, LCM3B Et bien d’autres ….