purification des protéines Caractérisation et purification des protéines Pr Eric Chabriere Eric.chabriere@afmb.univ-mrs.fr

Le dosage des protéines

1- mesure de l'absorption UV Les acides aminés aromatiques absorbent la lumière dans l'UV. Le maximum d'absorption à lieu à 280 nm (W). En mesurant la D.O (densité optique). On peut revenir à la concentration de protéine. el :coefficient d'extinction molaire (mol/cm) C : concentration (Mol) l : longueur de la cuve (en générale 1 cm) Loi de Beer-Lambert il faut connaître le coefficient d'extinction molaire. Il faut que la solution soit homogène. Le coefficient d'extinction molaire est déduit expérimentalement ou connu; On peut aussi facilement avoir une valeur approximative à partir la séquence de la protéine. 1mg protéine/ml a une absorbance à 280 nm d'environ 0.5-2.

Avantage: Bonne sensibilité (50-100 mg) Facile à mette en place Non destructif Désavantage: Peu adapté au mélanges Sensible au contamination (ex ADN 260nM, tampon). L'absorption du tryptophane est modulée par l'environnement (pH, force ionique) Très bonne méthode pour les protéines pures. Très intéressant pour comparer des concentrations entre des échantillons mesurés dans les mêmes conditions

2-dosage du bleu de Coomassie (Bradford) Le colorant bleu de Coomassie G250 s'adsorbe sur les protéines (acides aminés aromatiques) en milieu acide. Le colorant passe du rouge au bleu (absorbance à 595 Å) Inconvénient. Il a une réactivité différente selon les protéines. Par exemple il s'adsorbe beaucoup sur l'albumine. De plus la gamme de linéarité est très étroite (2mg-120mg) On l'utilise plutôt pour visualiser les protéines sur les gels

3-Dosage par la méthode de Biuret Le cuivre se complexe avec les azotes de la chaine principale à pH alcalin. Le cuivre ainsi coordonné absorbe à 540nM (violet). Défaut méthode peu sensible (1 mg). 4-Dosage à l'acide bicinchoninique (amélioration de la methode de Lowry) On couple le dosage par la méthode du Biuret avec l'acide bicinchoninique. Cu 2+ est réduit grâce à certains acides aminés (et par les liaisons peptidique à haute température,>37°c). Ensuite 2 molécules de BCA chélate spécifiquement Cu+1 et le complexe absorbe à 562nm (pourpre). Cette méthode est très sensible jusqu'à 2mg/ml. Très bonne linéarité et peu sensible aux détergents

Méthode expérimentale. On a une protéine de référence. En générale la BSA (Bovine serum albumin). On fait une gamme de dilution de 20mg/ml à 2mg/ml (gamme étalon). On met l'échantillon et la gamme étalon au contact des réactif (BCA). On laisse incuber 30 min à 37°C (à cette température la réduction du cuivre est proportionnelle au nombre de liaisons peptidiques) On mesure l'absorbation à 562nm. On utilise comme cuve de référence un tube sans protéine pour faire le blanc. La mesure de la DO reporté sur la courbe étalon indique la concentration en protéines de l'échantillon.

5-dosage par la mesure d'activité Si on travaille avec une enzyme, on peut estimer sa concentration à partir de la mesure de l'activité de l'échantillons (U.I ou Katal). U: 1 unité 1 mmole de substrat hydrolysé par min Kat: Katal 1 mol de substrat hydrolysé par s Pour cela il faut connaître l'activité spécifique de l'enzyme. U/mg ou Kat/mg Attention Il faut faire l'expérience dans des conditions précises (T°, pH, force ionique, …) car ces paramètres influencent l'activité d'une enzyme. Il existe de très nombreux substrats qui changent leurs absorbations U.V-visible ou leurs fluorescences lorsqu'il sont hydrolysés. (C'est très facile de mesuré l'activité) Absorbe à 410 nm

Avantage: On peut mesurer la concentration de l'enzyme même dans un mélange complexe. C'est un dosage très utilisé en médecine (ex phosphatase alcaline) Inconvénient: Applicable seulement aux enzymes Il faut une méthode (simple) de mesure de l'activité (substrat chromophorique). Il faut le faire dans de conditions précises. La mesure sera perturbée si plusieurs enzymes dans la solution catalyse la même réaction

6-dosage avec des anticorps Des anticorps polyclonaux ou monoclonaux peuvent être obtenus pour reconnaître avec une grande affinité et spécificité une protéine particulière. Partie lourde constante Les anticorps possèdent une partie constante sur la chaine lourde qui peut être reconnue par d'autres anticorps (anticorps anti-souris, anti-lapin, anti chèvre,…). Ces anticorps sont couplé chimiquement à des enzymes qui serviront de marqueurs. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Enzyme Ces enzymes peuvent être la phosphatase alcaline ou la peroxydase

La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse du para-nitrophénolphosphate : Hydrolysé, ce substrat devient jaune et absorbe à 405 nM. La peroxydase Cette réaction émet des photons. Détection par film photos ou camera CCD C'est une méthode très sensible

On peut faire des doubles sandwich pour améliorer la sensibilité Méthode. protéine On fixe la solution d'intérêt sur la plaque On sature la plaque avec des protéines (lait) pour éviter une fixation aspécifique On incube avec l'anticorps spécifique qui se fixe sur l'antigène. On incube avec L'anticorps anti-anticorps qui fixe sur le premier anticorps. On mesure la réaction (absorption ou la lumière émise) et peut obtenir la concentration grâce à un étalonnage Avantages: Très précis Très sensible en particulier avec la peroxydase automatisable On a pas besoin de purifier la protéine pour la doser Inconvénients. Nécessite des anticorps spécifiques Un peu lourd à mettre en place On peut faire des doubles sandwich pour améliorer la sensibilité

Electrophorèse

Plusieurs techniques de l'électrophorèse. PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) -PAGE native (linéaire, gradient, gel retard) SDS page IEF PAGE 2D PAGE Western blot

Le gel de polyacrylamide (PAGE) l'acrylamide peut polymériser pour former un gel Si on rajoute le bisacrylamide, agent pontant On obtient un gel réticulé La réaction de polymérisation se fait grâce à l'ajout de persulfate (générateur de radicaux libres et de TEMED (stabilisateurs des espèces radicalaires)

En général, le rapport acrylamide/bisacrylamide est de 19/1. Commercialement on trouve le polyacrylamide (acrylamide/bisacrylamide) à 30%(M/V) Plus la concentration de polyacrylamide est importante, plus les pores seront petits et plus il sera difficile aux proteines de grande taille de se mouvoir. En général on fait des gels de 5 à 15% de polyacrylamide

Force de coulomb Felec= Z. E PAGE -natif Si le pH est en dehors du points isoélectrique, une protéine est chargée. Négatif si pH > PI Positif si PH< PI Ainsi si on place une protéine dans un gel de polyacrylamide et dans un champs électrique, elle va migrer. Il y a une force proportionnelle à la charge et une force (frottement) proportionnelle à la taille de la protéine Force de coulomb Felec= Z. E Charge de la protéine Champs électrique générateur Ffrot Coefficient de viscosité Felec Force de frottement Ffrot= -aR.V vitesse Rayon de giration de la protéine Comme tout frottement, la vitesse va s'équilibrer lorsque les frottement seront égaux à la force de coulomb. Z.E=aR.V; Vitesse de migration =

Vitesse de migration = Dans une électrophorèse native-PAGE on sépare les protéines selon le rapport charge/rayon Pour visualiser les protéines, on peut colorer le gel avec le bleu de Coomassie. On peut aussi révéler les protéines la réaction forme un produit coloré

Avantages. On sépare les différentes protéines Les états d'oligomerisations sont conservées on peut faire migrer les protéines dans des condition non dénaturante Révélation par l'activité Inconvénients Les bandes de protéines sont larges (à cause du dépôt) On ne peut pas déterminer la masse moléculaire des protéines Réfléchir sur la polarité de l'électrophorèse (en fonction du pH)

PAGE-natif en gradient On coule un gel de polyacrylamide avec un gradient de 4 à 20% 4% Les protéines migrent, la concentration de polyacrylamide est de plus en plus forte. Elle finissent par stopper en fonction de leurs tailles. En calibrant avec des protéine de références dont les masse moléculaire sont connues. On peut déterminer la masse moléculaire. 20% Avantages -bandes mieux focalisées -détermination de la masse moléculaire -détermination des formes oligomériques (non dénaturant)

Gel retard Cette technique permet de détecter l'interaction d'une protéine avec une autre protéine, de l'ADN ou de l'ARN. On fait migrer dans un gel natif sur une piste la protéine seule, puis sur une autre le mélange protéine-ADN (ou ARN ou autres protéines). Etant donné que la migration s'effectue en fonction du rapport charge/masse, toute interaction changera ce rapport. protéine associée avec l'ADN Protéine seule En faisant varié la concentration d'ADN, on peut déterminer la constante d'association Avantage -met en évidence les interactions. -Permet de déterminer les conditions d'association (plusieurs partenaires, cofacteurs,…) - On peut déterminer approximativement la constante d'association

Réduit les ponts disulfure intra ou intermoléculaire SDS-PAGE (conditions dénaturantes) dodécyl sulfate de sodium (SDS) CH3(CH2)10CH2O-SO3- Na+ Mercaptoethanol Réduit les ponts disulfure intra ou intermoléculaire On mélange les protéines avec le SDS (et le mercaptoethanol). On chauffe 5 min à 90°. Les protéines sont dénaturées Les protéines fixent de grandes quantités de détergent (1,4 g de SDS par gramme de protéine). Cela masque complètement la charge naturelle de la protéine et lui donne une charge négative constante par unité de masse. La mobilité électrophorétique dépend alors principalement de la taille.

tampon:Tris/Hcl pH 8.8 et glycine Les gels SDS-PAGE sont constitué de 2 parties 1 gel de concentration tampon Tris/HCl pH 6.5 Polyacrylamide 4% tampon:Tris/Hcl pH 8.8 et glycine 1 gel de migration tampon Tris/HCl pH 8.8 Polyacrylamide de 6 à 15% (selon la taille des protéines) Lorsqu'on a applique le courant, les espèces négatives vont migrer vers l'anode le PI de la glycine 6.5: Peu chargée dans le gel de concentration (pH 6.5) Très chargée dans le gel de migration (pH 8.8)

Dans le gel de concentration (Stacking), Dans le gel de concentration (pH 6.5, acrylamide 4%) , les espèce négatives sont: -les ions chlorure (très mobile) -les protéines (mobile, chargées par le SDS) - La glycine faiblement chargé (peu mobile) Les ion chlorure avance très rapidement. Derrière eux, on trouve une zone sans transporteur de charge. S' il y a peu charge, il y augmentation du potentiel électrique U=RI. Ce fort courant électrique force la migration de la glycine et des protéines qui vont stacker au front de migration des ions chlorure. On obtient ainsi de très fines bandes de protéines ------------------ ------------------ gly prot Dans le staking gly Cl- prot Cl- ++++++++++++ ++++++++++++

Dans le gel de migration Lorsqu'on arrive dans le gel de migration (pH 8.8 polyacrylamide 6-15%) les espèces négatives qui vont migrer sont: -les ions chlorure (très mobile) -les protéines (chargés par le SDS) sont ralentie (% acrylamide plus important) - La glycine est chargé (très mobile) Les protéines, plus grosses, sont maintenant les espèces les plus lentes. La glycine passe devant les protéines ------------------ MW Les protéines arrivent en mêmes temps dans la gel de migration et restent sous formes de fine bandes. La migration se fait principalement en fonction de leurs masse moléculaire + prot gly Cl- - ++++++++++++

Estimation de la masse moléculaire (SDS-PAGE) En utilisant des marqueurs de tailles calibrées on peut estimer la masse des protéines. Si on représente la masse de la protéine en fonction du log de la distance de migration (a partir de la discontinuité) on a une relation linaire Souvent les marqueurs ne sont pas parfaitement purs, c'est pourquoi on utilise 2 kit de marqueurs différents pour identifier les protéines qui sont communes.

On adapte le % de polyacrylamide en fonction de la taille que l'on désire mesurer 8% 45-400 kDa 10% 22-300 kDa 12% 13-200 kDa 15% 2.5-100kDa Il existe de kit de haut poids moléculaires (HMW), de bas poids moléculaire (LMW), et couvrant une grande gamme de masse. Des marqueurs colorés qui permettent de suivre la migration en temps réel

- + - + Gel en gradient de pH (Isoelectrique Focusing, IEF) Dans un gel d'agarose ou de polyacrylamide 4%(pores larges), on place de nombreuses ampholytes qui possèdent des points isoelectriques différents. Les ampholytes sont des espèces qui se comporte à la fois comme un acide et une base. Par conséquent, a un certains pH (PI), elles sont neutres. générateur - + générateur - + acide base acide Gel + ampholytes base + - pH A pH acide, les ampholytes sont chargées positivent et vont vers la cathode A pH basique, les ampholytes sont chargées négativement et vont vers l'anode. Lorsque le pH est au point isoélectrique, l'ampholyte arrête sa migration Les différentes ampholytes s'organisent selon leur PI et forment un gradient de pH

Selon les ampholytes choisies, on peut avoir un gradient plus ou moins resserrés. Il existe aussi des gels de gradient de pH avec des ampholytes immobilisées prêt à l'usage Les protéines sont aussi des amphotéres. On dépose la protéine, n'importe où sur le gel. Elle va migrer et stopper au point isoélectrectique. + générateur - 6 8 PI pH

le gradient de pH est connu, par conséquent en repérant la migration de la protéine, on peut déterminer avec précision son point isoélectrique. L'IEF permet: -De déterminer expérimentalement le point isoélectrique d'une protéine -De séparer les protéines en fonctions du points isoélectrique -De mettre en évidence certains variant de la protéines mutations (charge) -modification post-traductionnelle (phosphorylation, glycosylation,…)

Gels bidimensionnelles On peut coupler un gel IEF avec un gel SDS dans l'autre dimension. Les protéines sont séparées dans une dimension selon leurs points isoélectriques puis par leurs masses moléculaires dans l'autre dimension. C'est un outil puissant pour la proteomique. Il permet de séparer jusqu'à plusieurs milliers de protéines. Pour identifier les protéines, on peut utiliser: -des anticorps -découper les spots et séquencer (Edman, MS/MS) - Découper les spots, digérer à la trypsine et identifier les protéines grâce à la spectrométrie de masse Monocyte 2D gel

Les techniques de révélation des PAGE -Révélation au bleu de coomassie -révélation par l'activité (natif-PAGE) -révélation au nitrate d'argent -révélation avec des anticorps (western-blot)

Révélation au nitrate d'argent (1000x plus sensible que le bleu de coomassie) Les groupe sulfhydrile et carboxylique des chaines latérales des protéines peuvent réduire l'ion argent. L'ion argent réduit est sensible à la lumière (principe du film photographique). La réaction est stoppée en milieu acide Attention les colorations au nitrate d'argent sont sensibles, mais dépendent de la composition en acide aminés et ne sont pas linéaires. On ne peut pas utiliser cette méthode pour comparer des concentrations de protéines. D'autre part, si on veut faire par la suite de la spectrométrie de masse, il faut utiliser des protocoles sans glutaraldehyde. Le cross linking pose des problèmes pour l'extraction de la protéine du gel et pour la digestion peptidique. 45kDa HPON1 39kDa HPBP

Western Blot Les anticorps ne vont diffuser librement dans le gel. Par conséquent on fait sortir les proteines du gel et on les fixe sur une feuille de nitrocellulose ou de polyVinyldene Fluoride (PVDF). - - - - cathode Papier imbibée de tampon proteines PAGE PVDF ou nitrocellulose Papier imbibée de tampon + + + + anode Si les protéines sont en SDS, elle sont chargées négativement, elles vont migrer vers l'anode et se fixer sur la membrane de nitrocellulose ou de PVDF. Si gel natif, on travaille à pH basique, (protéines chargées négativement)

révélation des western blot (similaire à ELISA) 1°) On sature la membrane avec des protéines (lait en poudre). Pour éviter que les anticorps se fixe aspécifiquement sur la membrane. 2°) On incube la membrane avec les anticorps spécifique 3) On incube la membrane avec les anticorps anti anticorps (anticorps secondaires) qui sont couplés avec une enzyme (alcaline phosphatase ou peroxidase) 4°) on révèle la membrane pour localiser les protéines reconnues par l'anticorps Attention, il faut que l'anticorps reconnaisse la protéine sous une forme dénaturée (SDS) membrane protéine

Souris normale GFM Il y a beaucoup de protéines dans le plasma Détection de HPBP dans le plasma de souris Le western blot permet de détecter, de doser et de caractériser facilement une protéine, parmi des milliers d'autres