Génie métabolique chez les végétaux Utilisation de la transgenèse chez les plantes dans le cadre de démarches de génie métabolique www.imagesdepicardie.com

Génie métabolique Optimisation des procédés de fermentation industrielle basée sur la compréhension et la modulation de voies métaboliques Conditions de culture Génie génétique Définition valable pour seulement pour des aspects très restreints du génie métabolique chez les végétaux

Génie métabolique végétal dans le cadre de cultures en « bioréacteurs » Production de métabolites secondaires par le biais de cultures de cellules ou de tissus végétaux en bioréacteurs Ex: Shikonine Masanaru Misawa « Champs de microbes » : utilisation industrielle de bactéries photosynthétiques par l’entreprise Solazyme Protéines recombinantes Caroténoïdes

Génie métabolique appliqué aux « plantes entières » Productivité Assimilation des éléments Tolérance aux stress Phytoremédiation Qualité Augmentation des teneurs Vitamines, Principes actifs médicamenteux, Pigments, Parfums, Arômes, Acides gras insaturés … Diminution des teneurs Glucosinolates, Acide érucique, Arômes indésirables, Tannins, Lignine Points abordés dans les cours

Génie métabolique appliqué à la production de composés à usage pharmaceutique et cosmétique

Principaux métabolites secondaires utilisés dans l’industrie pharmaceutique et cosmétique Alcaloïdes Alcaloïdes indoliques Etc.. Composés mixtes et glycosides Glycosides cardiotoniques Composés phénoliques Flavonoïdes, quinones … etc… Isoprénoïdes Tocopherol…etc..

Le problème de la production des métabolites IIaires Synthèse organique Lorsqu’elle est possible… Culture de plantes au champ Lorsqu’on la maîtrise Culture in vitro Lorsque les molécules en valent la peine…

Synthèse organique : les plantes comme modèle Souvent possible, à bas prix Ex : aspirine Réaction de Kolbe Mais, ce n’est pas toujours possible…

Culture de plantes aux champs Plantes médicinales ~7000 ha en France Culture peu coûteuse Mais, ce n’est pas toujours possible…

Exemples de plantes médicinales difficiles à cultiver L’if Pervenche de Madagascar

Autres organismes biologiques Expression hétérologue de gènes de plantes chez d’autres microorganismes hôtes ? Caractères fortement polygéniques Expression étroitement coordonnée de plusieurs dizaines de gènes dans la synthèse d’un seul métabolite Génie métabolique appliqué aux végétaux

Cultures in vitro pour la production de métabolites secondaires Un dogme ancien et erroné : « les suspensions cellulaires ne produisent pas de métabolites secondaires » (1940-1970) Une technologie récente (1975-1985) et des résultats assez peu nombreux…

Les espoirs initiaux 1956 : Pfizer inc. Dépose un brevet concernant la production de métabolites par des cultures cellulaires de plantes Fin des années 60 : La visnagine et la diosgenine sont produites à plus fortes concentrations dans des cultures cellulaires que dans les plantes Ça « coince » avec les molécules les intéressantes : vinblastine, vincristine… Un succès : la Xn de shikonine commercialisée en 1983 par Mitsui Petrochemicals

Japon : la tête de proue Outils de fermentation industrielle Extension aux cultures végétales 70s (Japan Tobacco Inc) production de biomasse pour la confection de cigarettes (réacteurs de 20 000 L) Meiji Seika, Nitto Denko Co : production de masse de Panax ginseng in vitro 1982 : 5ème congrès de l’IAPTC (=IAPB) au japon : nombreuses avancées dans la production de métab II, dont la shikonine par Mitsui Petrochemicals

Lithospermum erythrorhizon (Borraginacées) http://homepage1.nifty.com http://crop.nics.go.kr Cosmétique Phytothérapie Shikonine : 10% de la MS de la racine

Cultures en bioréacteur de cellules de Lithospermum erythrozhizon www.uni-tuebingen.de/pharmazie/abteilungen/biologie/de/shikonin.html

Trois succès durables Shikonine Berbérine Saponines du ginseng Cultures cellulaires Saponines du ginseng Cultures de racines à grande échelle

Un alcaloïde isoquinolique : la berbérine Malaria Principal alcaloïde accumulé dans le rhizome de Coptis japonica (Renonculacée) Années 70 : selection d’une souche hyperproductrice de berbérine, transférée à Mitsui Biochemicals Optimisation : culture à haute densité (optimisation de l’oxygénation et du milieu), 0.45 g /L / jour http://www48.tok2.com/home/

Production de saponines par Panax ginseng www.01sante.com/. ../ginseng.htm. Traitement des ulcères 5 ans de culture Destruction de la racine pour extraction Culture de racines en réacteur

Quelque systèmes de production à l’étude taxol Vinblastine, Vincristine Elly Lilly & Co Glycosides Concurrence avec la synthèse chimique

Paclitaxel (taxol) Écorce de Taxus brevifolia (If du pacifique) Propriétés pharmacologiques Antimitotique tubulo-affine Applications cancers à métastases Cancer de l’ovaire et du sein

Culture in vitro pour la synthèse de Taxol traitement 1g /an 1g = 3 arbres (Taxus sp., l’If) de 150 ans Productivité in vitro : 100-150 mg / L en deux semaines

Taxus baccata (Taxaceae) 10-désacétylbaccatine III dans les feuilles : récolte non-destructrice Précurseur d’hémisynthèse Toxotère® par Sanofi-Aventis

Catharanthus roseus (Apocynaceae) Le thé de pervanche utilisé en pharmacopée traditionnelle en Jamaïque comme antidiabétique Années 50 : Stimulation de la sécrétion d’insuline ?? Pas du tout mais diminution des globules blancs http://www.ntbg.org/plants/plantresource Traitement des leucémies

Vinblastine et vincristine Maladie de Hodgkin Leucémies Faible rendements … Vinblastine : 2-10 g (50-250 k€) / tonne de MS Vincristine : 0.5 g / tonne de MS

Les alcaloïdes de la pervenche de Madagascar Au moins 70 alcaloïdes identifiés dont : Dans les feuilles Vincristine et vinblastine (anticancéreux) Dans les racines et les suspensions cellulaires Serpentine et Ajmalicine : (antihypertenseurs)

Production d’ajmalicine par C. roseus Hypothèses : 800 Kg / an 260 µg ajmalicine / g MS / jour Suspensions cellulaires : 3150 $/Kg Plantes entières : 619 $ / Kg Au contraire la culture de Lithospermum est longue (maturité 3-5 ans) et sensible au variations climatiques : les cultures cellulaires sont plus rentables Source : FAO (http://www.fao.org/docrep)

L’hémisynthèse 1974 Équipe de Potier (Paris) Dimérisation de deux alcaloïdes monomeriques : catharantine et vindoline  vinorelbine (navelbineTM)

ß-methyl-digoxine (Digitalis) Cardiotoniques Mais de nouveaux cardiotoniques de synthèse sont apparus Les projets de production par CIV sont tombés à l’eau Les suspensions cellulaires sont tout de même utilisées pour réaliser les étapes finales :bioconversion

Bioconversion Premières étapes de synthèse chimique Finalisation des molécules par culture in vitro

Ajout de précurseurs dans le milieu de culture : bioconversion Amélioration Ajout de précurseurs dans le milieu de culture : bioconversion A B C A C coût B / coût C ? B

Bioconversion 12-hydroxylation de la beta-methyl-digitoxine  digoxine OH Reinhard et Alfermann 1982 Boehringer Mannheim Co : réacteurs de 4 000 L Digitalis lanata

Bioconversion des extraits végétaux Bioconversion des extraits par fermentation lactique en réacteur teneurs en trois ginsenosides d’interêt : X 60 Pathologies causées par Helicobacter pilorii (ulcères) Brevet (2003) Ginseng Science

Méthodes de production in vitro Du prototype à la technologie industrielle

Mise au point en flacons de culture

Production in vitro Principes de base La plupart des métabolites secondaires sont intracellulaires, intravacuolaires Quantité produite = biomasse produite X concentration

Biomasse Production in vitro Alors : dX =  dt X Nombre et ln X =  (t-t0) X0 Croissance exponentielle t0 Nombre de cellules X0 temps 3 semaines

Production de métabolites Production in vitro Quantité de métabolites secondaires Quantité de cellules temps Découplage croissance/synthèse de Métabolites Iiaires

Exemple : Production d’ajmalicine par Catharanthus en deux étapes: L’inoculation de la phase de production avec des cellules en phase stationnaire avancée donne une productivité 4 fois supérieure Indicateur : inoculation avec des cellules qui ont consommé tout le nitrate dans leur milieu Schaltmann et al (1996) Biotech. Bioengineering

Procédé de production de shikonine : batch en 2 étapes M9 Production MG5 Croissance . . 750 L 14 j 200 L 9 j Inoculum Shikonine 4 g/L Filtration Filtration Air Air Procédé de production de shikonine : batch en 2 étapes Tabata et al. Mitsui Corp.

Culture en bioréacteurs http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm

Passage du flacon au réacteur Dans certains cas : diminution de la synthèse : Catharantus Composition de la phase gazeuse: Taxus: Baisse de O2  augmentation taxol Augmentation CO2  diminution taxol Mirjalili (1996) Biotechnol Bioengineering

Réacteurs forte capacité Contrôle des paramètres pH, O2, nutriments, précurseurs, éliciteurs… Agitation, aération Qualité de lumière

Les freins du « scale up » Production in vitro Transferts de masse gaz-liquide (oxygène) Sensibilité au cisaillement ( 100 t/min) Homogénéisation du milieu : Sédimentation Attachement Contact cellules-liquide

Agitation mécanique Pales Tambour rotatif Bullage

Wave bioreactors http://www.wavebiotech.com

Culture d’organes Dans plusieurs cas, les cellules indifférenciées ne produisent pas la molécule désirée: cellules de Catharanthus : pas de vinblastine Cellules de pavot : pas de morphine Production de saponines par le Panax ginseng : culture de racines obligatoire

Culture d’organes Racines transformées (hairy roots) Croissance Production de molécules Stabilité génétique Cultures de tiges feuillées

Hairy roots de Psoralea lachnostachys Stratégies alternatives : hairy roots Hairy roots de Psoralea lachnostachys

Stratégies alternatives : hairy roots La croissance

« plantes à traire » Cultures en hydroponie Solution nutritive en circuit fermé avec filtration des métabolites exsudés par les racines INPL-ENSAIA, Nancy Datura inoaxia : Hyoscyamine, scopolamine (neurosédatifs) E. Gontier et F. Bourgaud

Perméabilisation de cellules Amélioration Perméabilisation de cellules Faire sortir les produits intracellulaires Petite taille moléculaire des métabolites secondaires  perméabilisation des membranes phospholipidiques

Optimisation de la synthèse Impact des conditions de culture sur la synthèse Elicitation

Comment augmenter la synthèse? Sélection de lignées fortement productrices Choix de la source carbonée et ajout de précurseurs simples Paramètres physiques et temporels de la culture Eliciteurs biotiques ou abiotiques Hormones

Elicitation par un facteur biotique de la synthèse de sanguinarine Un alcaloïde isoquinoléique synthétisé dans les suspensions cellulaires d’opium

TYDC TYDC TYDC

Elicitation des teneurs en sanguinarine par l’extrait de Botrytis Concentration cellulaire en sanguinarine (mg / g DW) Temps après élicitation (h) Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)

Elicitation de l’activité tyrosine décarboxylase par Botrytis Activité relative TYDC (%) Temps après élicitation (h) Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)

Un éliciteur « miracle » L’acide Jasmonique Un éliciteur « miracle »

Elicitation de la synthèse d’acide rosmarinique chez Lithospermum erythrorhizon Méthyl Jasmonate Control Yeast Extract Matsuno et al. 2002 FEBS Lett.

Matsuno et al. 2002 FEBS Lett.

Utilisation industrielle de l’acide jasmonique Elicitation des cellules de Taxus pour la synthèse de taxol Fin des années 90 : rendement multiplié par 100 en particulier grâce au méthyl-jasmonate La production industrielle in vitro devenait alors envisageable

Génie génétique et génie métabolique Stratégies moléculaires pour manipuler des voies de biosynthèse

L’outil moléculaire au service du génie métabolique Caractérisation des voies de biosynthèse Caractérisation des principales étapes enzymatiques Clonage des gènes correspondants Transgénèse Surexpression de gènes homologues De gènes hétérologues (plantes, bactéries…) RNAi

Transgenèse de lignées cellulaires ou de plantes entières Système plante entière insatisfaisant Système in vitro insatisfaisant Souches cellulaires transformées Plantes entières transformées

Stratégie « Étape enzymatique » Capell et Christou (2004) Curr. Opin. Biotech.

Modulation de la voie synthèse de la scopolamine chez Hyoscyamus Häkkinen et al.

Surexpression de la hyoscyamine 6-hydroxylase (H6H) et de la putrescine methyl-esterase (PMT) PMT + H6H Témoin PMT H6H Témoin racines transformées par A. rhizogenes Zhang et al.

Stratégie « Facteurs de transcription» Moduler l’expression de gènes codant les enzymes impliquée dans toute une chaîne de biosynthèse

Stratégie « Facteurs de Transcription »

Promoteurs régulés par le facteur de transcription ORCA3 Catharanthus Promoteurs régulés par le facteur de transcription ORCA3 Gantet et Memlik 2002 Trends in Pharm Sci

CONCLUSIONS Production de métabolites 2aires Quelques réussites en CIV De gros efforts de recherche depuis 40 ans L’espoir renouvelé par le génie génétique CIV Plantes entières

Lecture conseillée pour approfondir les aspects « bioréacteur »   PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF USEFUL METABOLITE http://www.fao.org/docrep/t0831e/t0831e00.htm#con

Génie métabolique et horticulture Moonshadow (Florigene) Manipulation de la voie de biosynthèse des anthocyanes

CHS F3’5’H F3’H DFR DFR DFR

Expression de la DFR de maïs chez le Pétunia 1987 (Nature) Premier succès : obtention de pétunias oranges contenant de la pelargonidine Expression hétérologue d’une DFR (dihydroflavonol réductase) de maïs

naringenine F3’5’H F3’H DFR de maïs DFR de pétunia

Comment obtenir une rose bleue ? (Pari lancé en 1840…) Les roses sont déficientes en F3’5’-hydroxylases : pas d’anthocyanes dérivées de la delphinidine

Surexpression de la F3’5’H Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600

Pour améliorer la qualité du bleu…. Silencing de la DFR de rose Surexpression de la DFR d’Iris Surexpression de la F3’5’H de violette F3’H F3’5’H

Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600

Génie métabolique et plantes aromatiques

Biosynthèse du menthol Amélioration quantitative et qualitative de l’huile essentielle de menthe par génie métabolique menthol OH

Trichomes glandulaires chez la menthe www.microscopix.co.uk/ plants/oils/. Turner et Croteau (2004) Plant Phy.

Le menthol : un monoterpène IPP Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

Deux approches Quantitative Qualitative Modulation des activités enzymatiques en amont de la voie de biosynthèse Qualitative Modulation des activités enzymatiques en aval de la voie de biosynthèse

Goulot d’étranglement ? DXR Plaste Cytosol Pyruvate + G3P DXPS 2 x acétyl CoA Goulot d’étranglement ? DXR MCT Mévalonate CMK MECPS Mévalonate 5-diphosphate 2-C-Méthyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate MDC IPPI Isopentényl diphosphate Diméthylallyl diphosphate Terpenoïdes

Surexpression de la 1-deoxyxylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR) chez la menthe poivrée Lignée Rendement huile (mg/g MF) Sauvage 1.8 DXR6 2.6 DXR7 2.3 DXR8 2.4 Augmentation de rendement sans changement de composition Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

Biosynthèse du menthol Mahmoud et Croteau (2001) PNAS Biosynthèse du menthol Cytochromes P450 (Réticulum) Leucoplastes Mitochondrie

Antisens sur la menthofurane synthase lignée Oil yeald (mg/g FW) Limonene Menthone Menthofurane Pulégone Menthol sauvage 1.7 2.3 60.2 13.9 7.8 4.0 MFS-as 1.8 2.6 68.8 5.3 2.8 7.3 Changement de composition sans changement de rendement Mahmoud et Croteau (2001) PNAS

Génie métabolique appliqué à la foresterie www.nazflora.org

Modification du contenu en lignine par transgenèse

Principaux constituants du bois Cellulose (50%) Lignine (25%) (exemple de polymérisation de quelques unités G) Hémicellulose (25%)

Problématique Fabrication de papier Ecorçage/Mise en copeaux Délignification au sulfate alcalin=procédé kraft Délignification au bisulfite (acide) Blanchiment : Chlore, Peroxyde Coût énergétique Impact environnemental La lignine : un facteur majeur de difficulté dans le procédé de fabrication Circuit fermé Effluents

Hu et al. 1999 Nature Biotechnology

Augmenter le ratio cellulose/lignine par génie génétique Stratégie n°1 : amélioration quantitative

Répression par stratégie antisens

Réprimer la 4CL, mais laquelle ? Chez le peuplier : deux isoformes Quelles sont leurs spécificités de substrat? Dans quels tissus sont-elles exprimées? Les deux isoformes contribuent-elles à la synthèse de lignines ?

Hu et al. 1998 PNAS

Pt4CL2 Pt4CL1 Spécificités de substrat des deux isoformes de la 4-coumarate:CoA ligase

Localisation histologique de l’expression de Pt4CL1 et Pt4CL2 Hu et al. 1998 PNAS Activité GUS Feuilles Tiges 4CL2 4CL1 Épiderme Xylème Northern Blot

Conclusions La 4CL1 est impliquée dans la synthèse des monomères de la lignine La 4CL2 est impliquée dans la synthèse d’autres composés phénoliques (métabolites secondaires) Pour altérer la synthèse des monomères de la lignine, une stratégie « antisens » doit être ciblée sur la 4CL1

Contrôle du phénotype : quantité de lignines Hu et al. 1999 Nature Biotechnology Témoin Témoin Lignées transgéniques % Lignin reduction Transgénique

Phénotype : ratio cellulose / lignine Hu et al. 1999 Nature Biotechnology Phénotype : ratio cellulose / lignine

Implications Vitesse de croissance accrue Avantage technologique Questionnement sur les flux de gènes ? Effets secondaires possibles de la diminution des niveaux de lignine Attaques pathogènes Décomposition du bois dans la litière  rôle de puit de carbone pour les arbres

Modifier la composition de la lignine par génie génétique Stratégie n°2 : amélioration qualitative

Bois dur ou bois tendre ? Lignine G Lignine S/G

Hu et al. 1999 Nature Biotechnology

La lignine : un polymère d’unités phénylpropanoïdes Liaison moins résistante : procédé de fabrication du papier plus facile Lorsque la position 5 est disponible pour la polymérisation : lignine plus résistante

Approche retenue: expression de la F5H sous le contrôle d’un promoteur de la C4H spécifique des tissus du xylème

% de lignine S dans les transformants Huntley et al (2003) J. Agric. Food Chem.

Efficacité de la mise en pâte chimicothermomécanique

Conclusions Le génie métabolique appliqué à l’amélioration des espèces ligneuses horticoles, aromatiques ou médicinales est une approche crédible Cette approche ouvre un champ large d’applications Plusieurs applications sont déjà au stade de la commercialisation