Détermination de la concentration en protéines par dosages colorimétriques Il est souvent nécessaire de connaître la concentration totale en protéines d’un milieu. ex : pour suivre les différentes étapes d’une purification.

1. Les protéines Définition? Les protéines sont constituées d’un enchaînement de plus d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques.

Unité de base des protides (monomère). Acides aminés (aa) : Unité de base des protides (monomère). Comme leur nom l’indique, ils sont constitués : - d’une fonction acide (COOH) et d’une fonction amine (NH2). Leur nom varie selon le radical R. Il sont non hydrolysable. Parmi les 20 aa, 8 aa sont dits indispensables. -------

Petits polymères de 2 à 100 aa Peptides Polymères de plus de 100 aa Les monomères Acides aminées Petits polymères de 2 à 100 aa Peptides Polymères de plus de 100 aa Protéines ------- ------- -------

Les liaisons peptidiques ------- Les liaisons peptidiques -------

généralement : méthodes spectrophotométriques basées sur diverses : De nombreuses méthodes ont été mises au point pour doser les protéines. généralement : méthodes spectrophotométriques basées sur diverses : caractéristiques spectrales ou réactionnelles des acides aminés constituant les protéines. -------

choix méthode dépend des besoins et des caractéristiques recherchées: spécificité, fiabilité, sensibilité, facilité de mise en œuvre, rapidité, coût, taille des échantillons, possibilité de récupérer l'échantillon après dosage, présence de substances interférentes dans l'échantillon, automatisation possible ou non etc. -------

2. Principe d'une gamme étalon et d'une droite d’étalonnage On utilise trois types de solution : une solution de concentration connue d'une protéine = référence ou standard par rapport à la protéine à doser. une solution de la protéine à doser dont on veut déterminer la concentration = échantillon à doser (essai) une solution de réactif qui développe une coloration en réagissant avec des acides aminés spécifiques de ces protéines.

La solution de concentration connue permet de constituer une gamme étalon : série de tubes qui contiennent un volume final identique mais des quantités croissantes et connues de la protéine de référence.

En même temps, une série de tubes, contenant différents volumes de prise d'essai de la protéine à doser, est préparée.

La solution de réactif est ajoutée au même moment dans tous les tubes afin que la coloration se développe dans les mêmes conditions pour la gamme étalon et l'échantillon à doser.expliquer autre possibilité

On laisse réagir dans les conditions et le temps nécessaires puis on mesure l'absorbance de tous les tubes. A partir des tubes de la gamme étalon on trace une courbe d’étalonnage : absorbance = f (quantité protéine par tube) ou f (concentration en protéines par tube)

Cette proportionnalité permet de déterminer la quantité de protéine contenue dans un volume de prise d'essai de l'échantillon à doser. sans oublier les facteurs de dilution

3. Méthodes colorimétriques les plus courantes pour la détermination de la concentration en protéines Méthode du Biuret - Méthode de Folin-Lowry et coll (1951) modifiée par Peterson (1977) - Méthode de Bradford au bleu de Coomassie

Au cours de 3 séances de TP que nous allons réaliser ensemble nous allons tester les différentes méthodes photométriques et nous comparerons leurs critères de praticabilité dont la sensibilité. Nous allons commencer par la réaction dite « au biuret » : Rappel cours :

Principe : Les ions cuivriques (Cu2+) en milieu fortement alcalin forment des complexes avec les atomes d’azote des groupements peptidiques => coloration violet avec peptides et protéines

Consignes : En entête du compte rendu : titre date matériel utilisé (matière d’œuvre) liste des réactifs utilisés avec pictogrammes de sécurité et mesure de sécurité à prendre  rechercher les pictogrammes de sécurité et mesure de sécurité sur bouquin : aldrich, sigma Internet : inrs, si vous trouver les sigles de l’ancienne et de la nouvelle nomenclature les retranscrire tous les deux dans le cahier.

1ère séance : on vous donne le tableau = résumé de protocole puis progressivement, vous allez devoir élaborer par vous même le tableau à partir du protocole. Explication du tableau de manipulation : sens de lecture colonne et ligne et chronologie de la réalisation Tube gamme étalon 1 2 3 4 5 réactif de Gornall (mL) eau physiologique (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 étalon SAB 10 g/L (mL) volume total (mL) 2,5 Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. masse de protéines par tube (mg) [protéines] dans le tube (mg/mL) absorbance à 545 nm (A545)

Reconstituer le tableau SAB/EB dans un seul tableau. Pourquoi ? Tube gamme étalon 1 2 3 4 5 réactif de Gornall (mL) eau physiologique (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 étalon SAB 10 g/L (mL) volume total (mL) 2,5 Homogénéiser (vortex) soigneusement. Laisser incuber 10 minutes à température ambiante. masse de protéines par tube (mg) [protéines] dans le tube (mg/mL) absorbance à 545 nm (A545) Pourquoi ajout du réactif ou de la solution prot connue et essai en dernier ? car ils déclenchent la réaction de coloration Reconstituer le tableau SAB/EB dans un seul tableau. Pourquoi ? car on traite tous les échantillons : gamme/étalons et essais dans les mêmes conditions et en même temps (répétabilité optimale)

Rappelez moi les principales étapes de la réalisation d’une dilution en fiole jaugée ? Remplir la fiole jaugée propre et sèche au ¾ avec le diluant attention de pas se tromper : eau physiologique ou avec Brij35à 0,01 % (v/v) Ajouter le volume prélevé avec la P5000 dans la fiole Homogénéiser  attention SAB protéine donc formation de mousse Ajouter du diluant jusqu’à 1cm du trait de jauge tout en rinçant les parois de la fiole Ajuster le volume au trait de jauge avec une pasteurette en plastique (bas du ménisque sur le trait de jauge) Fermer l’orifice de la fiole avec du papier film étirable Homogénéiser par retournement

Conseils réalisation gamme : Quelle précaution doit on prendre pour délivrer un liquide dans un tube? Faire toucher la pointe du cône sur la paroi du tube incliné à 45°C, pipette toujours tenue droite Conseils réalisation gamme : Décaler les tubes dans le portoir après chaque ajout Vérifier le niveau équivalent dans les tubes quand on a atteint le volume total A la fin vérifier que la couleur des essais se situe à l’œil dans la gamme Avant de commencer la manipulation : me montrer  le tableau complété les Formules Littérales (FL) les Applications Numériques (AN) pour les calculs du tableau.

Exploitation des résultats : Faire un tableau de données obtenues : avec valeurs courbe étalonnage + valeurs essais Déterminer la masse de prot/tube pour les essais (EB) Calculer la [prot] dans EB Faire apparaître dans le layout sur Igor : toutes les formules et calculs Exprimer les résultats avec les écarts types dans le compte rendu

Expression des résultats : Avec les règles de métrologie : écart type de répétabilité Sr = 0.4 g/L Attention au nombre de chiffres significatifs après la virgule, comment exprimez vous les résultats? En fonction de quoi? en fonction du Sr si il est donné avec 4 chiffres après la virgule, il faut exprimer le résultat avec 4 chiffres après la virgule Comment peut on savoir si on peut faire la moyenne des résultats obtenus pour les essais ? moyenne possible : si E1-E2  à 2.8 x Sr (écart type de répétabilité) bien remplir les fiches de vie du matériel, préciser le nom et n° du spectro, le n° des pipettes utilisées Attente en fin de TP biuret : CR entier + tableau 2ème séance de TP folin lowry à valider

Questions supplémentaires

Questions supplémentaires réponse attendue dans CR connaissant la [EB] par la mesure à 280 nm, pourquoi doit-on le diluer au 1/5 dans cette technique ? Justifier la couleur du tube 0 de la gamme étalon