Biologie moléculaire - jour 1 ADN plasmidique superenroulé

ATCase J2 - variabilité dans le plateau

ATCase J2 - difficile à interpréter

ATCase J2 - superbes résultats Effecteurs allostériques Désensibilisation Michaelis-Menten Lineweaver-Burk Eadie-Hofstee Hill n = 1,3-1,8 native: sigmoïde +Hg: michaelienne native: recourbée +Hg: linéaire n = 0,93-1,1 + hg n = 1,6 native

Biologie moléculaire - but exécuter une série d'expériences démontrant les principes fondamentaux de la biologie moléculaire

Biologie moléculaire - objectifs purification des acides nucléiques (ADN plasmidique et ARN) analyse par électrophorèse sur gel d'agarose enzymes de restriction et carte de restriction d'un plasmide polymérisation en chaîne (PCR)

Biologie moléculaire - organigramme Jour 1 Purification des ADN plasmidiques et gel d'agarose Jour 2 Coupure des ADN par les enzymes de restriction et gels d'agarose PCR Jour 3 Gel d'agarose des produits de PCR Extraction d'ARN et gel d'agarose

Biologie moléculaire- organigramme Purification des ADN plasmidiques et gel d'agarose (compte rendu à remettre) Purification d’ADN de 2 plasmides à partir de cultures bactériennes Extraction et purification d’ARN de foie de lapin Polymérisation en cascade (PCR) Coupure des ADN par les enzymes de restriction Analyse sur gel d’agarose (0,8%) et compte rendu Analyse sur gel d’agarose (2%) et compte rendu Analyse sur gels d’agarose (1%) Analyse sur gel d’agarose (1%) et compte rendu Préparation des cartes de restriction et compte rendu

Plasmides molécules d'ADN extrachromosomiques circulaire ADN double brin répliquent de façon autonome

Plasmides fréquemment encodent résistance à un antibiotique facile à isoler vecteurs de choix dans la technologie de l'ADN recombinante

Préparation d'ADN plasmidique libérer l'ADN plasmidique de la bactérie la purifier de l'ADN génomique et des autres composantes cellulaires

Préparation d'ADN plasmidique Trois étapes principales 1. Croissance de la culture bactérienne (+antibiotique, O/N, culture saturée) 2. Récolte et lyse des cellules bactériennes 3. Purification de l'ADN plasmidique (entre autres, du chromosome bactérien)

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche)

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) récolte des bactéries

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) récolte des bactéries resuspension des bactéries (vortex)

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) récolte des bactéries resuspension des bactéries (vortex) lyse alcaline (NaOH/SDS; vortex)

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) récolte des bactéries resuspension des bactéries (vortex) lyse alcaline (NaOH/SDS; vortex) précipitation des membranes et du chromosome bactérien (tampon de liaison = KOAc acide)

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) (vortex) (vortex)

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) Récolte des bactéries Lyse alcaline (NaOH/SDS) Précipitation des membranes et du chromosome bactérien (tampon de liaison = KOAc acide)

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) récolte des bactéries resuspension des bactéries lyse alcaline (NaOH/SDS) précipitation des membranes et du chromosome bactérien (tampon de liaison = KOAc acide) "pêcher" l'ADN plasmidique par colonne d'affinité

High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche)

Gel d'agarose - analyse de l'ADN ADN est chargée négativement (phospates) migre vers le + (vers l'anode) plus le fragment est large, moins il migre taille des pores détermine la migration taille des pores déterminée par [agarose]

Électrophorèse sur gel d’agarose L’agarose forme un support poreux au travers duquel les molécules d’ADN ou d’ARN se déplacent. La migration des molécules est effectuée sous l’influence d’un courant électrique. Les molécules d’ADN ou d’ARN sont séparées selon la taille ou la conformation. La visualisation des molécules d’ADN ou d’ARN est rendue possible par la présence d'un produit dans le gel qui se lie à l'ADN et devient fluorescent sous la lumière UV.

Gel d'agarose - visualisation de l'ADN Conventionnellement avec EtBr bromure d'éthidium s'intercale dans l'ADN devient fluorescent (orange) aux rayons UV photographie (filtre orange), donne des bandes blanches sur un fond noir

Gel d'agarose - visualisation de l'ADN sous les UV photographie à traverse un filtre orange

un mutagène très puissant Solution: EtBr - problème un mutagène très puissant Solution: utiliser un produit plus sécuritaire SYBR Safe SYBR Green I SYBR Gold GelRed

BCM311 - visualisation de l'ADN on utilise GelRed meilleur mélange de: sensibilité stabilité toxicité versatilité

EtBr - sécurité certains laboratoires l'utilise encore soyez attentif: portez des gants pensez à ne pas contaminer le laboratoire changez vos gants s'ils sont contaminés

Gels d'agarose - préparation agiter couvrir éviter les bulles

Points technique - gels d'agarose TRÈS important de bien rincer l'Erlenmeyer avec de l'eau chaude IMMÉDIATEMENT sinon, l'agarose restant fige = problèmes de lavage les appareils d'électrophorèse ne vont pas à la laverie peigne -Labnet 1ère coche (côté blanc vers l'intérieure) -Pharmacia 2ième coche

Points technique - gels d'agarose laissez figer suffisamment de temps portez attention en enlevant les blocs de caoutchouc - allez lentement enlever le peigne après les blocs de caoutchouc

Gel d'agarose - taux de migration taille [agarose] conformation de l’ADN courant appliqué

ADN plasmidique - conformation superenroulé relâché linéaire Relaché Superenroulé

ADN plasmidique - conformation La position de ces formes peut varier selon le plasmide et les conditions d'électrophorèse.

ADN plasmidique - conformation direction de migration superenroulé linéaire

Marqueurs de taille utiliser pour déterminer la taille de l’ADN graphique de log taille vs la distance migrée λH3 -ADN de bactériophage λ -digéré avec HindIII

Graphique - log taille vs distance pas linéaire pas de courbe de tendance (droite) log10taille = 3,05 taille = 1100 pb Distance de migration=18cm

Points techniques les cultures sont fournies il faut préparer le 50X TAE (100 ml) EDTA 0,5 M est préparée pour vous stériliser le 50X TAE entre J1 et J2 (vous allez l'utiliser J2 et J3)

Points techniques prenez seulement 2 tubes à filtre "High Pure" et 2 tubes à collection par équipe (c.-à-d. une de chaque par préparation) tube à collection tube à filtre "High Pure"

Points techniques prenez seulement 2 tubes à filtre "High Pure" et 2 tubes à collection par équipe (c.-à-d. une de chaque par préparation) remplacer la tube à collection par un Eppendorf propre pour l'élution de l'ADN pur

respecter l'ordre des échantillons sur le gel Points techniques respecter l'ordre des échantillons sur le gel Puits Échantillon 1 λHindIII 2 Plasmide A linéarisé 3 Plasmide A (1 μl) 4 Plasmide A (3 μ l) 5 Plasmide B linéarisé 6 Plasmide B (1 μl) 7 Plasmide B (3 μ l) 8 1 kb ladder

plusieurs marqueurs durant les 3 jours Points techniques plusieurs marqueurs durant les 3 jours 1 kb ladder λH3 ФX174/HaeIII ne sont pas tous à la même concentration respecter les quantités indiquées dans les notes de cours

Enzymes-tampons-nucléotides-marqueurs 1 boîte/table à -20oC gardez sur glace en tout temps retournez les tubes à -20oC après l'utilisation (ne jeter pas les restants!) 1 boîte/table pour vos échantillons d'ADN (bien les identifier, ne pas jeter vos plasmides) pas de plasmide = perte de points HindIII vs λH3

Point technique - volumes en biomol biologie moléculaire = petits volumes (~10 μL) soyez prudent dans vos pipettages toujours sur glace « quick spin » avant d'ouvrir un tube vérifier le volume aspiré rentrer l'embout dans le liquide avant la livraison surveiller la livraison

Point technique - nucleases embouts + tubes stériles toujours portez des gants et changez-les souvent remplir les boîtes uniquement quand vide portez des gants quand vous remplissez les boîtes d’embouts boîtes remplies à l'autoclave

préparation des solutions Points techniques préparation des solutions tampon STE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,1 M NaCl; 1 mM EDTA) (préparer 100 ml / table, stériliser par filtration) TAE 50X (préparer 100 ml par équipe)(stériliser entre J1 et J2, garder pour J2 et J3) À noter: Pour stériliser à l'autoclave il faut que la bouteille ne soit pas plus que 50-60% rempli.

sur les images des gels faire attention de: Compte rendu à compléter au labo sur les images des gels faire attention de: identifier les puits indiquer les tailles des bandes du marqueur indiquer, si le marqueur est "synthétique", le fournisseur

Questions ADN plasmidique superenroulé