RISQUE MICROBIEN : Les produits de la 4ème Gamme Juin 201 - Enseignant responsable : X. DOUSSET RISQUE MICROBIEN : Les produits de la 4ème Gamme Camille STREIFF – Alexandre CANALI- Matthieu MOISSONNIER - ING 2

A. Les Produits de la quatrième gamme Fruit et légumes frais Pas de traitement thermique Prêt à consommer (lavés, découpés, parés) DLC courte (de l’ordre de 7 jours) Doivent être conservés < 4°C

1.Problématiques spécifiques Produit vivant : respiration = chaleur, 02-, CO2+, H2O+ Blessures dues au process : accélération respiration, production d’éthylène accélérant la sénescence, vulnérabilité aux attaques bactériennes, brunissement enzymatique Pas de traitement thermiques

2.Solutions proposées Froid : température < à 4°C : ralentissement des réactions. Lavage-désinfection : lutte contre les microorganismes Atmosphère modifiée (N2, CO2) : inhibition brunissement enzymatique, effets bactériostatiques et fongistatiques Le CO2 inhibe la sénescence

Mais… Le manque d’O2 favorise les anaérobies (bactéries lactiques) Le manque d’O2 ou l’excès de CO2 favorise un métabolisme fermentaire. Le CO2 est toxique pour certaines plantes

Source : Vierling 1998, Aliments et boissons : technologies et aspects réglementaires.

Photo : http://genome.jgi- psf.org/leume/leume.home.html 3.Leuconostoc spp Coques Gram + oxydase – catalase – Anaérobies facultatifs Hétéro-fermentaires Pathogène opportuniste Ubiquitaires Forme des biofilms Photo : http://genome.jgi- psf.org/leume/leume.home.html

3.a. Effets Piqure lactique gazogène : fermentation des sucres entrainant acidification et production de CO2. acidification, gonflement voire éclatement possible des sachets

3.b. Culture Exigences nutritionnelles : milieu Mayeux Sanidine Elliker Incubation lente 4 à 5 jours Acidophiles (pH optimal 4,5) Peut se développer de 1 à 30°C (opt 25°C)

Photo : http://www.thesilveredge.com/pseudomonas.shtml 4. Pseudomonas spp Gram - oxydase + catalase + Aérobies stricts, certains peuvent extraire l’02 par réduction des nitrates en azote Photo : http://www.thesilveredge.com/pseudomonas.shtml Se développe bien dans les sols humides, mais mauvais compétiteur dans un environnement riche en matières organique Pathogène opportuniste Ubiquitaires Forme des biofilms

4.a. Effets Coresponsable de la pourriture molle : - Dégradation aqueuse des tissus - Odeur pestilentielle Photo : http://www.omafra.gov.on.ca/IPM/french/brassicas/diseases-and-disorders/bacterial-soft-rot.html

4.b. Culture Sur tous les milieux usuels Alcalinophiles Peut se développer de 4 à 42°C

4.c. Sources de contamination L’eau d’irrigation : principalement les éclaboussures de sol sur les légumes pour Pseudomonas. Biofilms dans les conduites. La terre Les parasites (vers, insectes, larves) pour Pseudomonas Les matériels et locaux Les personnels

4.d. Précautions à prendre Elimination parasites/larves (Pseudomonas), lutte contre les insectes broyeurs Eviter les blessures Eliminer les produits blessés ou visiblement infectés Nettoyage des conduites d’eau Hygiène des personnels et des locaux

LR Béva Nutrition: nutrinnovation.blogspot.fr B- Étude du diagramme de fabrication, des opérations de stabilisation et étude HACCP LR Béva Nutrition: nutrinnovation.blogspot.fr

1. Diagramme de fabrication Réussir fruits & légumes cultivons l’expertise: www.reussirfl.com 1. Diagramme de fabrication

2.(1/3) Une opération de stabilisation de la denrée: l’étape de lavage-désinfection 3 phases: Lavage: Elimination de matière organique + résidus de terre Désinfection: au chlore seul auxiliaire technologique autorisé en France Rinçage: Elimination des résidus chlorés

2.(2/3) Une opération de stabilisation de la denrée: l’étape de lavage-désinfection « La désinfection est une opération au résultat momentané, qui permet d’éliminer ou de tuer les micro-organismes et/ou d’inactiver les virus indésirables portés par des milieux inertes contaminés, en fonction des objectifs fixés » (norme AFNOR NF T 72-101, mars 1981)

2.(2/2) Une opération de stabilisation de la denrée: l’étape de lavage-désinfection Source: Réduction de la flore microbienne des salades prête à l’emploi par désinfection au chlore. (TIRILLY. Y, 1999 Technologie des légumes). seul traitement de préservation maintien de la qualité microbienne dans un bain bouillonnant l’eau de désinfection et de nettoyage des ustensiles doit être potable Chlore total = Chlore combiné + Chlore libre 4 paramètres: - Temps de contact: 1 min - Température: 4°C - la concentration en chlore actif : 50 - 100 mg/litre - pH < 8 « La désinfection est une opération au résultat momentané, qui permet d’éliminer ou de tuer les micro-organismes et/ou d’inactiver les virus indésirables portés par des milieux inertes contaminés, en fonction des objectifs fixés » (norme AFNOR NF T 72-101, mars 1981). Elle entraîne donc une diminution des micro-organismes vivants, mais elle ne supprime généralement pas les spores bactériennes. L’utilisation du chlore, en liaison avec la bonne maîtrise des autres étapes, permet d’améliorer sensiblement la qualité microbienne du produit. L’atelier peut utiliser une dose de chlore de 120ppm maximum dans le bain de désinfection. L’opération doit impérativement être suivie d’un rinçage. L’approvisionnement en eau froide et chaude exclusivement potable, sous pression et en quantité suffisante, doit être assuré pour toutes opérations où les produits sont en contact avec de l’eau, et pour le nettoyage et le rinçage des matériels et ustensiles. Trois paramètres y sont contrôlés : la quantité utilisée : 5 à 10 L par kg de légume la température de 4°C qui refroidit les légumes la concentration en chlore actif : 100 mg/litre 19

3.(1/2) Étude HACCP de l’étape de lavage-désinfection HACCP = Analyse des dangers et maîtrise des points critiques identifie et de spécifie les prescriptions d’hygiène d’importance cruciale à appliquer à une opération de production alimentaire donnée pour assurer l’innocuité microbiologique et la salubrité d’une matière première ou d’un aliment déterminé. (Journaux officiels, 1991). CCP (« point critique à maîtriser ») : est une étape ou un point auquel on applique une mesure de contrôle et où il est essentiel de prévenir ou d'éliminer un ou plusieurs dangers pour la salubrité des aliments ou, encore, de les réduire à un niveau acceptable. Il est nécessaire de limiter le nombre de CCP aux dangers les plus importants, et donc les plus urgents à maîtriser. 20

3.(2/2) Étude HACCP de l’étape de lavage-désinfection A chaque étape un point critique car pas de traitement thermique pour détruire la flore microbienne. Danger physique: corps étrangers causant des blessures à la personne Danger chimique: causé par des substances - intentionnel (pesticides, nitrites…) - accidentel ( produit de nettoyage) - naturel Danger biologique: du à des défauts d’une étape précédente ( micro-organisme, parasite, virus…)

3.a Les dangers, mesures préventives et correctives La contamination des produits peut provenir de l’étape de parage qui a été mal menée, de l’environnement (air…), du personnel ou bien du matériel utilisé (couteaux, cuves, ou machines en général). Ainsi, les méthodes de nettoyage sont très strictes. La croissance microbienne peut notamment provenir d’un non-respect de la chaîne du froid (lorsqu’un dysfonctionnement des machines frigorifiques a lieu, ou bien lorsque les produits restent trop longtemps dans la zone de réception par exemple). Risque Contamination microbienne par l’eau de rinçage Contamination excessive par des résidus du traitement de désinfection Point critique de contrôle Charge microbienne du bain de rinçage Efficacité du rinçage Maîtrise Renouvellement en continu de l’eau du bain de rinçage Maintien de la température de l’eau à un niveau adéquat Cadence appropriée au temps nécessaire pour le rinçage Renouvellement du bain Surveillance Débimètre et relevé périodique du débit Relevé périodique de la température de l’eau Contrôle par la comptabilité matière Quantité d’agent désinfectant dans l’eau de rinçage Caractéristiques organoleptiques du produit fini Analyse de la dose résiduelle de désinfectant dans le produit fini. Tableau 3: Récapitulatif des dangers lors du lavage-désinfection (d’après VIERLING. E. Conditions hygiéniques et sanitaires de production et de mise sur le marché. ) 22

3.b Les risques, leur maitrise et leur surveillance Tableau 5: Description des risques d’après le Journal officiel de la République. Hygiène alimentaire

4.Calcul de la Criticité pour la contamination des Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa) IPR = G * O * D   Indice de priorité du risque = gravité *occurrence*détectabilité la gravité d’une contamination par Pseudomonas aeruginosa est très forte pour les personnes immunodéprimées. Les Pseudomonas se développent à une température de 30°C le risque de non-détectabilité de Pseudomonas est faible. IRP = 4  Danger faible Échelle de 1 à 4 La gravité L’ingestion malencontreuse de L. monocytogenes peut conduire à divers symptômes tel un état pseudo-grippal apparemment bénin, notamment chez la femme enceinte. L'infection par L. monocytogenes provoque une maladie, la listériose. Les symptômes sont plus importants chez le fœtus et le bébé (méningite néo-natale, ou fausse couche) chez les adultes ou jeunes immunodéprimés : les infections sont en général non détectées. Ainsi, la gravité d’une contamination par L. monocytogenes est très importante. La fréquence On estime la période à laquelle la défaillance est susceptible de se reproduire.   L. monocytogenes peut se développer à basse température, contrairement à la plupart des autres bactéries. Elle résiste d'autant mieux que la température est basse est la surface poreuse. Cependant, les produits de IVème gamme ne font pas partie des aliments « à risque ». Le danger est donc faible. La détectabilité Elle exprime l'efficacité du système permettant de détecter le problème. La réglementation concernant la détection de Listeria monocytogenes est très stricte, les contrôles sanitaires et les techniques d’analyses sont nombreux. La prévention passe aujourd'hui par la surveillance (de la fourche à la fourchette en Europe) du procédé de fabrication. Ainsi, le risque de non-détectabilité de Listeria monocytogenes est faible. Résumé: 4ème gamme = aucun risque majeur Dégradation rapide du produit par les phytopatogènes avant toute possibilité de développement des pathogènes humains Pas de traitement thermique susceptible de détruire la flore microbienne 24

5.Diagramme d’Ishikawa (Méthode des 5M) 25 25

C. Analyse de l’étude suivante: Growth potential of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in nine types of ready-to-eat vegetables stored at variable temperature conditions during shelf-life

1. Introduction But: Détermination de la croissance potentielle de Salmonella spp. et de Listeria monocytogenes dans 9 produits de 4ème gamme selon les conditions de stockage  Visualisation des conditions critiques. Dépend des interactions microorganisme-microorganisme et microorganisme-végétal. Infectiosité : L. monocytogenes  Ingestion de fortes doses (> 8 log10 CFU/g) pour un individu sain.  Ingestion de faibles doses (2-3 log10 CFU/g. Salmonella spp.  Très variable.

2.(1/3) Matériel et méthode 5 souches de Salmonella spp. et 5 souches de Listeria monocytogenes :  Mise en culture et préparation de suspensions à 108 CFU/mL. Végétaux utilisés : Laitue, choux, épinard, cresson, roquette, carottes râpées, salade verte et mix pour yakisoba (brocolis, chou, chou-fleur, poireau, blette, carotte). Sous atmosphère modifié. Un seul jour de stockage après production. Inoculation des produits  concentration finale de 103 CFU/g. Conditionnement sous atmosphère modifié avec 5% O2, 15% CO2 et 80% N2.

2.(2/3) Matériel et méthode Conditions de stockage : I : 100% de la durée de vie à 7°C±1°C II : 30% à 7°C±1°C et 70% à 15°C±1°C III : 100% à 15°C±1°C Pour chaque condition, préparation d’un témoin eau stérile. Milieu MCLB, 24h à 37°C  Colonies mauves à centre noir = Salmonella spp. Milieu OXA, 48h à 37°C  Colonies brunes avec hydrolyse de l’esculine = Listeria monocytogenes. Milieu PCA, 37±1°C pendant 48±3h = Microorganismes aérobies. Milieu MRS, 37±1°C pendant 48±3h = Bactéries lactiques.

2.(3/3) Matériel et méthode Numération à t0 et à tfinale  Détermination du potentiel de croissance δ (significatif si > 0.5 log10 CFU/g) Confirmation sur 3 colonies par des tests biochimiques et sérologiques. Détermination d’une activité antimicrobienne. Culture sur milieu MRS, dépôt d’une fine couche de milieu BHI contenant Listeria monocytogenes  Observation d’apparition d’un halo d’inhibition.

3.(1/3) Résultats et discussion Les deux principales sorties des tests de croissance potentielle sont la détermination d’une « croissance ou non croissance » représenté par un δ positif ou négatif. Il n’y a aucune relation entre les valeurs de pH et le δ des microorganismes n’a été démontré. Les données montrent que le potentiel de ces deux pathogènes n’est pas dépendant du type de produit. Activité antimicrobienne de la carotte sur Listeria, qui s’applique de manière plus forte à Salmonella et aux bactéries Gram négatif. Dans les conditions de stockages abusifs II et III, Listeria monocytogenes est capable de croitre dans tous les produits étudiés, excepté la carotte.

3.(2/3) Résultats et discussion Pour Salmonella, il y a possibilité de croissance dans la laitue, le chou, l’épinard, le cresson, la roquette, la salade verte et le yakibosa Dans la majorité des produits de 4ème gamme et des conditions de stockage, le nombre microorganismes aérobies a augmenté significativement. La population de bactéries lactiques a augmenté significativement dans la majorité des conditions de stockage et des produits étudiés, excepté pour le chou et le cresson en condition I et II, et le mix yakibosa en condition I. Il n’y a qu’à la température de 15°C que cette population a montré une activité antimicrobienne. Cependant, cette activité ne peut pas être associé à une production de bactériocines, mais plutôt à la production de métabolites toxiques (acides organiques) ou bien la compétition pour l’acquisition des nutriments du milieu.

3.(3/3) Résultats et discussion En conclusion, il a été montré que Salmonella et L. monocytogenes possède un potentiel de croissance dans la plupart des produits de 4ème gamme étudiés La meilleure manière de contrôler leurs croissances est de maintenir la température de stockage à 7°C.