Les Protéines Solubles du Lait

Constituants biochimiques du lait Composants Teneurs (g) Eau 90.5 Azote protéique caséines protéines solubles Azote non protéique 3.27 2.71 0.56 0.17 Matière grasse 3.7 Glucides 4.8 Minéraux 0.8 Gaz dissous 5% volume Extrait sec 12.8 Composition moyenne de 100 mL de lait

Matières protéiques azotées du lait Caséines (27 g/L) b-lactoglobulines (3 g/L) Protéines solubles = Protéines du lactosérum a-lactalbumines (1.25 g/L) Caséines aS1 (10 g/L) Caséines b (9.8 g/L) Caséines k (3.3 g/L) Caséines aS2 (2.6 g/L) Caséines g (1.3 g/L) Immunoglobulines (0.7 g/L) SAB (0.4 g/L) Lactoferrine (0.2 g/L)

Le Lactosérum On appelle lactosérum (sérum ou petit lait) : La phase aqueuse qui est séparée du caillé lors de la fabrication du fromage ou de la caséine Le lactosérum contient la plus grande partie de l’eau du lait ainsi que toutes les substances solubles telles que: Le lactose Les protéines solubles ou sériques Les sels minéraux et organiques solubles Les composés azotés non-protéiques Des traces de matières grasses On appelle lactosérum (sérum ou petit lait) : La phase aqueuse qui est séparée du caillé lors de la fabrication du fromage ou de la caséine Le lactosérum contient la plus grande partie de l’eau du lait ainsi que toutes les substances solubles telles que: Le lactose Les protéines solubles ou sériques Les sels minéraux et organiques solubles Les composés azotés non-protéiques Des traces de matières grasses

Le Lactosérum  de lactose On distingue deux catégories de sérum, selon que son acidité est inférieur ou supérieur à 1,8 g d’acide lactique par litre : Le lactosérum doux issu de la fabrication de fromage à pâte pressé cuite ou non cuite Le lactosérum acide issu des autres fromages obtenus par coagulation mixte ou lactique (pâtes molles, pâtes fraîches) ou de caséinerie les sérums acides contiennent:  de lactose + de minéraux, notamment de calcium et de phosphore, On distingue deux catégories de sérum, selon que son acidité est inférieur ou supérieur à 1,8 g d’acide lactique par litre : Le lactosérum doux issu de la fabrication de fromage à pâte pressé cuite ou non cuite (emmenthal,sain-paulin,…) Le lactosérum acide issu des autres fromages obtenus par coagulation mixte ou lactique (pâtes molles, pâtes fraîches)

Le Lactosérum Lactosérum doux Lactosérum acide Matière sèche (MS)   Lactosérum doux Lactosérum acide Matière sèche (MS)  55 à 75  55 à 65 Lactose 40 à 57  38 à 55 Lipides (MG) 0 à 5 0 à 2 Matières azotées totales 9 à 11 7 à 10 Cendres (MM) 4 à 6 6 à 8 Calcium 0,4 à 0,6 1,2 à 2,1 Phosphore 0,4 à 0,7 0,5 à 1,0 Potassium 1,4 à 1,6 Chlorure 2,0 à 2,2 Acide lactique 0 à 0,3 7 à 8 Composition g/L

Obtention du lactosérum Lait Fromagerie 10 L Caséinerie Fromage Sérum Caséine Sérum En moyenne, on peut considérer qu’il faut 10 litres de lait pour fabriquer 1Kg de fromage de type pâtes pressées (saint-paulin) et l’in récupère 9 à 12 litres de lactosérum selon les quantités d’eau utilisées au cours du process. Nous allons nous concentrer maintenant sur la composition en protéines solubles du lactosérum et nous allons aborder tout d’abord les protéines majoritaires du lactosérum 1 kg 9-12 L

Protéines du lactosérum Protéines majeures La b-lactoglobuline L’a-lactalbumine Protéines mineures Les Immunoglobulines (Ig) La sérum albumine bovine La lactoferrine La Catalase La Sulfhydryle oxydase La Lactoperoxydase Le nombre de protéines –dites majeures- du lactosérum se monte à deux : la B-lactoglobuline et l’alpha-lactalbumine. En nombre de moles, les autres protéines du lactosérum sont considérées comme négligeables. Mais d’une point de vue enzymatique, ce type de considération est discutable. Dans bien des cas, la présence de ces protéines s’avère non négligeable. Toutes les pièces de la panoplie enzymatique du lait ne sera pas présentée aujourd’hui.

Protéines Majeures du Lactosérum Composition en acides aminés Protéines sériques majeures b-Lg a-Lg Asp Glu Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Val Ile Leu Phe Tyr Met Cys Lys His Arg Trp 11 16 5 9 8 7 3 14 10 22 4 15 2 12 6 13 1 Total 162 123 Environ 50% des acides aminés sont des acides aminés essentiels Moles de résidus/mole protéine

Protéines Majeures du Lactosérum: La b-lactoglobuline Structure primaire et secondaire 162 résidus d’acides aminés 2 ponts disulfure; MM = 18,3 kDa Haut degré de structuration => compacte, globulaire, ordonnée Structure tertiaire La B-lactoglobuline est une protéine dont la masse moléculaire se situe autour de 18,3 kDa et sa concentration dans le lait varie de 2 et 4 g/l . La B-lactoglobuline bovine est constituée de 162 résidus d’acides aminés et comporte 2 ponts disulfure ainsi qu’une fonction thiol sur l’un des trois résidus cystyle en position 106,119,121. La présence d’un tel groupe nucléophile, dans l’éventualité d’une accessibilité suffisante du groupe fonctionnel, doit nous faire envisager la possibilité de formation de ponts disulfure. Ceci est vérifié lors de chauffages à haute température et à un pH> 6,5, il s’opère des polymérisation de B-lactoglobuline (dans ce cas nous somme en présence d’un état dénaturé de la protéine). On dénombre actuellement 7 variants génétiques, mais les plus fréquents sont les variants A et B. La différence entre ces deux variants se situe au niveau du résidu d’acide aminé 64 (aspartyle pour le variant A, glycyle pour le variant B) et 118 (valyle pour le vairant A, alanyle pour le variant B) Au pH naturel du lait, le Variant A est légèrement plus chargé négativement que le variant B, ceci permet de les séparer aisément par électrophorèse ou par chromatographie d’échange d’ions des protéines. La B-lactoglobuline bovine possède un haut degré de structuration, avec une très forte proportion de feuillets Beta (environ 43 à 50% des résidus d’acides aminés se situent dans ce type de structure secondaire), de 10 à 15% de la séquence primaire en hélices alpha et de 15 à 20 % en courbure Beta. Compte tenu de la disposition sur la séquence primaire et des structures secondaires, il existe certainement un compactage Beta-Alpha-Beta (donc une hélice alpha prise en sandwich entre deux feuillets Beta). Ce compactage, combiné à la richesse en feuillets Beta, assurerait l’existence d’une cœur hydrophobe au sein de la B-lactoglobuline qui conduit à une structure spatiale très serrée comme nous pouvons l’observer sur le schéma. Le monomère présenté ici sur le schéma aurait la forme d’un cône flasque ou d’un calice. Sa très forte ressemblance avec la protéine transporteuse de rétinol (Vitamine A) du plasma sanguin a incité les chercheurs à savoir si la B-lactoglobuline n’avait pas un rôle de transport de la vitamine A lors de la digestion. C’est effectivement le cas, La B-lactoglobuline est capable de fixer la vitamine A, ce qui semble profiter à l’espèce humaine : il existerait dans l’intestin du nouveau-né un récepteur membranaire spécifique du complexe B-lactoglobuline-rétinol qui permettrait le passage dans le sang (et donc assimilation) de la vitamine A du lait de vache (le lait humain ne contient pas de B-lactoglobuline). La lactoglobuline, ne fixe pas seulement de la vitamine A mais aussi des acides gras, des lipides et plus généralement des molécules hydrophobes comme les molécules aromatiques. Enfin la structure très compacte de la b-lactoglobuline, grâce à l’empilement des feuillets B, au compactage Beta-Alpha-Beta et au maintien de la structure tridimensionnelle par les ponts disulfure, permet probablement à cette protèine de rester parfois intact après son passage dans l’estomac. Structure quaternaire de la B-lactoglobuline. Au pH naturel du lait, la B-lactoglobuline existerait sous la forme d’un ensemble bi-unitaire (pas de liaison covalente on ne peut pas parler de dimère), à l’aspect pseudocylindrique pour un diamètre de 3,58 nm et une hauteur de 6,93 nm. La B-lactoglobuline intervient dans la formation du goût de cuit des laits chauffés protéine capable de fixer la Vitamine A fixation aussi de molécules hydrophobes (arôme) Structure quaternaire Ensemble bi-unitaire (3,58 nm sur 6,93 nm)

Protéines Majeures du Lactosérum: L’a-lactalbumine Structure primaire et secondaire 123 résidus d’acides aminés 4 ponts disulfure; MM = 14,2 kDa Structure proche du lysozyme Structure tertiaire L’alpha-lactalbumine est une petite protéine de 123 résidus d’acides aminés (masse moléculaire de 14,2 kDa) que l’on trouve dans le lait à la concentration massique de 1 à 15,5 g/l. L’alpha-lactalbumine est le constituant le plus caractéristique du lactosérum, car il est présent dans le lait de tous les mammifères. Il s’agit d’une métalloprotéine dont la structure est fortement ordonnée par des ponts disulfure et un cation. Sa structure primaire comprend 123 résidus d’acides aminés, dont une cinquantaine sont identiques en séquences à ceux de lysozymes de diverses origines animales. Enfin , les 4 ponts disulfure qui structurent ces deux protéines sont dans des positions identiques. Il est a noter aussi qu’il existe deux variants génétiques (notés A et B). L’alpha-lactalbumine B est la plus fréquemment rencontrée dans le lait. A la place du résidu arginyle 10 du variant B, on trouve pour le variant A le résidu glutamyle 10. Le lysozyme et l’alpha-albumine diffère assez peu dans leurs activités biologiques. Par exemple l’alpha-lactalbumine semble posséder les mêmes propriétés dans l’activité de lyse des parois bactériennes que le lysozyme, quoique beaucoup moins efficace. Structure secondaire de l’alpha-lactalbumine l’alpha-lactalbumine, contrairement à la B-lactoglobuline, possède un degré d’organisation de sa structure secondaire assez faible. Devant cette faiblesse en structure secondaire, on pourrait s’attendre à une structure tridimensionnelle de cette protéine plus lâche que celle de la B-lactoglobuline. Or, il semble que ce ne soit pas le cas; les raisons pourraient provenir de la présence d’un ion bivalent dans la structure et des ponts disulfure. Structure tertiaire et Rôle du calcium dans la structure de l’alpha-lactalbumine Si la conformation de l’alpha-lacalbumine est tenue par 4 ponts disulfure, cette structure est rigidifiée aussi par la présence d’ion calcium associé au cœur de la protéine, au contraire du lysozyme bovin qui n’en comporte pas. Sur un autre plan fonctionnel, l’alpha-lactalbumine est le facteur de régulation d’un système enzymatique : la lactose synthétase. Cet enzyme est constitué de deux parties ; la protéine A est à elle seule un enzyme qui transfère le galactose sur la glucosamine (pour former la lactosamine ou d’autres dérivés); la protéine B est identique à l’alpha-lactalbumine; elle se lie à la protéine A par simple adsorption et joue le rôle de modificateur de spécificité; les deux protéines réunies transfèrent le galactose sur le glucose, assurant ainsi la synthèse du lactose. Fixation Ca2+ Rôles du Ca2+ dans le maintien de la structure L’a-lactalbumine intervient dans la biosynthèse du lactose

Protéines Mineures du Lactosérum Les Immunoglobulines (Ig) Famille hétérogène de Glycoprotéines qui possèdent des activités d’anticorps : IgG1, IgG2, IgA, IgM et IgE Concentration massique dans le lait : 0,45 à 1g/l Masses Moléculaires entre 150 et 1000kDa Ces immunoglobulines sont transférées du sang au lait au niveau des cellules des glandes mammaires Famille majoritaire dans le lait : IgG Intro protéines mineures Ces protéines jugées comme mineurs dans le lait sur un critère quantitatif n’en méritent pas moins quelques précisions quant à leur nature. Dans bien des cas, leur présence s’avère non négligeable. Je ne citerai pas cependant toutes les pièces de la panoplie enzymatique du lait. Les immunoglobulines (Ig) sont une famille hétérogène de glycoprotéines qui possèdent des activités d’anticorps. Leur concentration massique dans le lait varie en moyenne de 0.4 à 1.0 g/l. Leurs masses moléculaires s’étendent largement, de 150 à 1000 Kda. Leurs points isoélectriques varient de 5,5 (protéine acide) à 8,3 (protéine basique) On range ces protéines en cinq catégories : IgG1 (0.3 à 0.6g/L), IgG2 (0.05 à 0.1g/l), IgA (0.05 à 0.15g/L), IgM (0.05 à 0.1G/L) et IgE. Toutes ces protéines ont une base structurale commune en forme de Y. Ces immunoglobulines sont transférées du sang au lait au niveau des cellules des glandes mammaires. Les IgG qui sont proportion prédominante dans le sang représentent aussi dans le lait la famille majoritaire des immunoglobulines.Concernant le poids technologique de ces protéines, on estime qu’il est minime, à tort peut-être du fait de leur complexation avec d’autres protéines sériques lors de traitements thermiques. Cette complexation pouvant jouer un rôle positif ou non contre la dénaturation des protéines par chauffage.

Protéines Mineures du Lactosérum La sérum albumine bovine Présence dans le lait 0,1 à 0,4 g/L. Masse Moléculaire 69000 kDa Dans le sang: transporteur d’acides gras insolubles La fixation d’acides gras (acide laurique et stéarique) la protégerait des dénaturations thermiques Dans le plasma: transport des métabolites physiologiques (acide biliaires) des hormones (thyroxine, testostérone), ou encore des médicaments (salicylates, digitaline, antibiotiques) La sérum albumine bovine (SAB) présente dans le lait (0.1 à 0.4g/l), n’est pas synthétisée par la glande mammaire et est identique à l’albumine de sérum sanguin de vache. Constitué de 582 résidus d’acides aminés (masse moléculaire 69000 kDa, cette protéine est structurée grâce à 17 ponts disulfure intramoléculaires qui permettent des repliements très serrés de la chaîne peptidique en des points précis. Globalement la sérum albumine bovine occupe dans l’espace le volume d’une sphère. Un modèle plus complexe de cette protéine propose un modèle constitué de trois zone globulaires contiguës, les trois parties étant contenues dans le volume d’une sphère. La sérum albumine est connue dans le sang pour son rôle de transporteur d’acides gras insolubles. La fixation d’acides gras (acide laurique et stéarique) la protégerait des dénaturations thermiques. D’autres acides gras, les acides palmitique et oléique dont les esters composent majoritairement les triglycérides du lait, se fixent aussi à la sérum albumine, à raison de 4.5 moles d’acide gras par mole de protéine. La seule autre protéine du lactosérum qui semble capable de fixer des acides gras serait la B-lactoglobuline (0.5 mole d’acide gras par mole de monomère b-lactoglobuline). Outre sa capacité à fixer des acides gras et des lipides, la sérum albumine peut servir dans le plasma de transporteur de métabolites physiologiques (exemple : acides biliaires), dhormones (thyroxine, testotérone) ou encore de médicaments (salicylates, digitaline , antibiotiques).

Protéines Mineures du Lactosérum La lactoferrine Concentration dans le lait 0,2 g/l Chaîne peptidique simple d’une masse moléculaire d’environ 80 000 kDa 689 résidus d’acides aminés et présente 69% d’homologie avec la lactoferrine humaine Elle possède au moins 16 ponts disulfures Transporteur d’ion ferrique Rôle important dans l ’assimilation du fer Rôle bactériostatique dans le lait en privant certains micro-organismes de fer indispensable Fe3+ Anion (carbonate probablement) Résidus osidiques La lactoferrine dont la concentration dans le lait est d’environ 0,2 g/L; consiste en une chaîne peptidique simple d’une masse moléculaire d’environ 80 000 Kda. La structure primaire de la lactoferrine se compose de 689 résidus d’acides aminés et présente 69% d’homologie avec la lactoferrine humaine et elle possède au moins 16 ponts disulfure. La figure présente le modèle de structure dans l’espace de la lactoferrine bovine, établi par analogie au modèle de la lactoferrine humaine qui serait constituée de deux lobes (N et C), les lobes se structurant en deux zones englobant un ion ferrique. Ainsi la lactoferrine est une protéine porteuse d’ions ferrique (Fe3+) et fixe l’ion ferrique accompagné uniquement d’un anion bicarbonate. Le degré de saturation serait de 20% dans le lait. La lactoferrine est la seule protéine connue du lait qui est capable de stabiliser l’ion ferrique. Par exemple, l’albumine ou des hydrolysats de caséine ne peuvent par stabiliser le fer ferrique, qui, seul en solution, passe à l’état ferreux (Fe2+) et devient insoluble. La lactoferrine apparaît donc actuellement comme le seul transporteur d’ion ferrique dans le lait. Cette propriété jouerait ainsi un rôle important dans l’assimilation du fer et par conséquent en nutrition humaine. La lactoferrine jouerait aussi un rôle bactériostatique dans le lait en privant certains micro-organismes de fer disponible. L’arrêt de la prolifération d’espèce comme Clostridium à même été démontré dans des expériences in vivo : la lactoferrine bovine exerce même après ingestion un effet bactériostatique sur Clostridium dans l’intestin.

Protéines Mineures du Lactosérum La Sulfhydryle oxydase C’est une métalloglycoprotéines (MM = 89 000 g/mol) qui catalyse l’oxydation des ponts disulfure : 2R-SH + O2 -> R-S-S-R + H2O2 Cette enzyme sert probablement au maintien de la structure de certaines protéines structurées par un ou des ponts disulfures dans le lait La sulfhydryle oxydase de masse moléculaire 89 000 g/mol est une métalloglycoprotéine des membranes des vésicules de matières grasses du lait qui catalyse l’oxydation des ponts disulfure 2R-SH + O2 -> R-S-S-R + H2O2 La sulfhydryle oxydase est un oxydant efficace des protéines, peptides ou gluthathion réduit. Cette enzyme pourrait ainsi très probablement servir au mantien de la structure de certaines protéines structurées par un ou des ponts disulfure dans le lait.

Protéines Mineures du Lactosérum La Catalase, liée à du matériel membranaire présent dans le lait, se compose de 4 sous-unités identiques de 60 000 g/mol Cette enzyme catalyse la réaction : 2H2O2 -> 2H2O + O2 Elle protégerait le lait de réactions radicalaires et donc de dénaturations protéiques. Elle élimine aussi H2O2 de la réaction précédente La Catalase, liée à du matériel membranaire présent dans le lait, se compose de 4 sous-unités identiques de 60 000 g/mol et catalyse la réaction : 2H2O2 -> 2H2O + O2 Elle protégerait le lait de réactions radicalaires et donc de dénaturations protéiques. Elle élimine aussi H2O2 de la réaction qui suit

Protéines Mineures du Lactosérum La Lactoperoxydase (30 mg/l; MM = 78 000 kDa) est l’enzyme la plus fréquemment dosée dans le lait La disparition de son activité étant totale lors d’une pasteurisation (72°C, 15s) On évalue son activité dans le lait pour vérifier l’efficacité de la pasteurisation La Lactoperoxydase de masse moléculaire de 78000 kDa, dont la concentration dans le lait est d’environ 30 mg/l est l’enzyme la plus fréquemment dosée dans le lait. Sa déactivation étant totale par pasteurisation (72°c, 15s) on évalue son activité dans le lait pour vérifier l’efficacité de la pasteurisation

Technologies appliquées au lactosérum Eau Lactose Protéines Maintenant nous allons discuter des différentes techniques utilisées pour l’obtention des protéines de lactosérum.Globalement le lactosérum est constitué essentiellement d’eau de lactose et des protéines qui nous intéressent. Il faut donc réussir à l’isoler les protéines de l’eau et du lactose et pour cela trois technique sont utilisées : la thermocoagulation, l’ultrafiltration et la technique d’échange d’ions. Précipitation non thermique Thermocoagulation Ultrafiltration Échange d’ions Protéines de lactosérum

Thermocoagulation Principe Lactosérum Thermocoagulation ménagée à pH controlé (5 < pH <7.5) Traitement Thermique doux Précipitation/ Séparation Utilisée également pour la fabrication de coprécipités Il existent diverses techniques d’extraction. Le procédé le plus ancien est la thermocoagulation. Thermocoagulation : c’est la précipitation des protéines dénaturées par chauffage, souvent en milieu acide. Ce procédé consiste à porter à ébullition du lactosérum acidifié à pH 4,6-4,7. Dès 63°C, les protéines commencent à floculer; la précipitation est totale peu après ébullition. Leur récupération se fait par filtration ou décantation. Ce produit, pressé pendant 24 heures, donne un fromage connu depuis très longtemps (fromages de petit lait). On peut aussi réaliser un lait de protéines qui est réincorporé au lait de fromagerie (procédé Centri-Whey). La thermocoagulation est un procédé qui ne modifie pas la valeur nutritionnelle des protéines mais modifie défavorablement leurs propriétés fonctionnelles. Aussi semble-t-il préférable de recourir aux procédés modernes que sont l’ultrafiltration et les échangeurs d’ions. Lavage/séchage Protéines Risques de dénaturation des protéines

Ultrafiltration Principe Séparation sur membranes semi-perméables Lactosérum Ultrafiltration Rétentat Perméat Évaporation Séchage Osmose inverse Ces techniques utilisent les procédés à membrane, qui permettent de séparer les éléments en suspension ou en solution dans un liquide, en le faisant circuler sur une membrane percée de millions de pores de dimension connue. Ces membranes semi-perméables peuvent être de nature cellulosique, plastique, métallique ou céramique. Initialement développées par l’industrie nucléaire pour séparer les isotopes de l’uranium, puis par les médecins pour la dialyse rénale, ces techniques ont été adaptées au traitement du lait et de ses sous-produits. Ainsi l’ultrafiltration est employée pour traiter le lactosérum issu des fabrications fromagères classiques. Cette utilisation constitue même la principale application de l’ultrafiltration, puisque 80% des membranes de l’industrie laitière mondiale y sont consacrés. La récupération des protéines du lactosérum permet de réduire le caractère polluant de ce produit tout en le valorisant (caractère polluant du fait du déversement du lactosérum dans des cours d’eau, où il serait à l’origine de pollution grave due à la fermentation de ses matières organiques et à la diminution de la teneur en oxygène dissous dans l’eau). Ces protéines solubles concentrées sont utilisées en alimentation animale, incorporées dans des préparations culinaires industrielles (charcuterie, biscuiterie) et employées pour l’alimentation des patients en réanimation ou souffrant d’insuffisances digestives (pour le apport en acides aminés) Concentré Protéique du Lactosérum Eau Concentré de lactose

Ultrafiltration Rétentat Perméat Concentré protéique Jus lactosé Solution enrichie en  lactalbumine Concentré protéique 1° UF 2° UF Lactosérum Eau de diafiltration

Ultrafiltration Facteurs de concentration Volume de sérum X = Volume de rétentat Différents concentrés protéiques Sérum S35 S50 S65 S85 Humidité (%) 3 4 Protéines (%) 13 35 52 63 83 Lactose (%) 75 22 MG (%) 1 7 Cendres (%) 9 6 5 X - 12 24 >35 Le perméat obtenu après l’ultrafiltration va contenir l’eau, les sels minéraux, les matières azotées non protéiques et le lactose. Ainsi ce qui va caractériser le rétentat, sera sa teneur en protéines dans la matière sèche, puisque ce rétentat sera ensuite séché en poudre. Pour conduire une installation d’ultrafiltration, on travaille avec des capteurs volumètriques en mesurant le facteur de concentration x x= volume de sérum/ volume de rétentat On détermine un facteur de concentration en fonction du taux de protéines que l’on veut obtenir. Ainsi pour obtenir une poudre à 35% de protéines, X est égal à 5,5;

Procédé par échange d’ions + Évolution de la charge nette d’une protéine en fonction du pH - Type de protéines Point isoélectrique  Lactoglobuline 5.2  Lactalbumine 5.1 Sérumalbumine 4.9 immunoglobulines 5.8-7.3

Échange d’ions : Procédé VISTEC Procédé avec échangeur carboxy-méthyl-cellulose (CMC) Adsorption des protéines sur CMC en milieu acide +H3N Prot +H3N Prot +H3N Prot Cellulose + acide chloracétique CMC

Échange d’ions : Procédé VISTEC Lactosérum HCl mélange Adsorption Protéines-CMC CMC L’adsorption des protéines par échange d’ions La propriété fondamentale de la C.M.C. est d’absorber spécifiquement les molécules de protéines en abaissant le pH du milieu, et de les relarguer ensuite par une nouvelle augmentation du pH. Dans le cas du procédé Vistec de la société BIO-isolates ( Grande-Bretagne), que je présente ici, on mélange le lactosérum avec les billes de carboxy-méthyl-cellulose. On ajoute de l’acide chlorhydrique pour acidifier le milieu à un pH donné. On lave à l’eau : on obtient un lactosérum déprotéiné acide. On ajoute ensuite de la soude pour remonter le pH : les protéines, presque totalement pures, sont relarguées. Elles peuvent ensuite être concentrées et séchées. L’intérêt de ces protéines purifiées est qu’elles ont de très intéressantes propriétés fonctionnelles, notamment un pouvoir moussant supérieur à celui de l’œuf. Le procédé d’échange d’ion ou Procédé Sphérosil : avec ce procédé une chromatographie est réalisée avec des billes de silice poreuse sur laquelle ont été gréffés les groupements échangeurs d’ions. Lavage eau NaOH Lactosérum déprotéiné Protéines

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL Le lactosérum est percolée sur la colonne de sphérosil échangeur d’ions Les protéines restent adsorbées sur la colonne La colonne est lavée à l’eau de façon à éliminer la solution déprotéinée restant dans son volume liquide L’élution des protéines se fait : Sur les échangeurs d’anions par des solutions acides Sur les échangeurs de cations par des solutions basiques Après élution, la colonne est lavée à l’eau pour être réutilisée Pour les deux procédés Sphérosil qui dépendent du type de lactosérum acide ou doux (pH différents). La solution de protéines à traiter est percolée sur la colonne de sphérosil échangeur d’ions. Les protéines restent adsorbées sur la colonne. La colonne est lavée à l’eau de façon à éliminer la solution déprotéinée restant dans son volume liquide. L’élution des protéines se fait : sur les échangeurs d’anions par des solutions acides Sur les échangeurs de cations par des solutions basiques Après élution, la colonne est lavée à l’eau de façon à éliminer la solution restant dans son volume liquide. Elle peut être ensuite directement utilisée. Dans le cas du lactosérum, le procédé est différent selon que l’on veut traiter du lactosérum doux ou du lactosérum acide.

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL Types d’échangeurs Sphérosil DEA: échangeur d’anions faible (C2H5) N+ Cl- Sphérosil QMA: échangeur d’anions fort (CH3)3N+ Cl- Sphérosil XOB015: échangeur de cations faible COO- H+ Sphérosil S: échangeur de cations fort SO3- H+

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL Cas du lactosérum acide Utilisation d’une colonne Sphérosil échangeur de cation Au pH du lactosérum acide (pH : 4,6), l’ensemble des protéines est sous forme cationique et s’adsorbe sur l’échangeur de cations Utilisation d’un échangeur Sphérosil S Cas du lactosérum acide On utilise une colonne de Sphérosil échangeur de cation. Au pH du lactosérum acide (pH: 4,6), l’ensemble des protéines est sous forme cationique et s’adsorbe sur l’échangeur de cations. L’éluat protéique, après concentration, séchage, donne une poudre contenant 90% de protéines

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL LS acide 45 6 Protéines (g/L) 1200 10900 10000 Volume (L) Eluat Lactosérum déprotéiné Lactosérum Lactosérum acide: Bilan d’un cycle LS déprotéiné Sphérosil S eau NH4OH Eluat Séchage SO3-H+ + ProtNH3+ SO3- +NH3Prot Régénération par HCL dilué

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL Cas lactosérum doux Au pH du lactosérum doux (pH : 6,6), la plupart des protéines sont sous forme anionique adsorption sur échangeur d’anions une faible proportion (7 à 10%) constitué d’immunoglobuline sous forme cationique adsorption sur échangeur de cations Utilisation de deux colonnes : une colonne de Sphérosil échangeur d’anions (QMA) une colonne de Sphérosil échangeur de cations faible (XOB015) Lactosérum doux : On met en œuvre 2 colonnes - une colonne de Sphérosil échangeur d’anion (QMA) - une colonne de Sphérosil échangeur de cations (XOB 015) Au pH du lactosérum doux (Ph : 6,6), la plupart des protéines sont sous forme anionique et s’absorbent sur échangeur d’anions et une faible proportion (7 à 10%) essentiellement constitué d’immunoglobuline est sous forme cationique et s’absorbe sur échangeur de cations.

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL LS doux LS déprotéiné Sphérosil XOB015 Sphérosil QMA NH4OH HCl 0.1N Eluat A Eluat B Eau Séchage (CH3)3 N+ Cl- + Prot COO- (CH3)3N+ -OOC Prot + Cl-

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL Lactosérum doux: Bilan d’un cycle Lactosérum doux Lactosérum déprotéiné Eluat sphérosil QMA Eluat sphérosil XOBO15 Volume (L) 10000 11500 750 95 Protéines (g/L) 6 60 40 Lactosérum doux Lactosérum acide Fraction sphérosil QMA Fraction sphérosil XOB015 Fraction sphérosil S Protéines 90 Lactose <0.5 MG Eau 9 6 Ca 0.7 1.1 0.8 P 0.5 0.6 Caractéristique des concentrés obtenus par le procédé Sphérosil (g/100g)

Échange d’ions : Procédé SPHEROSIL Les concentrés de protéines obtenus par chromatographie sont appelés isolats  de protéines sériques afin de les différencier de ceux obtenus avec les membranes Ces ingrédients ont une teneur en protéines d’environ 90% Ces ingrédients sont complètement délactosés Ces ingrédients ont une faible charge minérale Lactosérum doux : On met en œuvre 2 colonnes - une colonne de Sphérosil échangeur d’anion (QMA) - une colonne de Sphérosil échangeur de cations (XOB 015) Au pH du lactosérum doux (Ph : 6,6), la plupart des protéines sont sous forme anionique et s’absorbent sur échangeur d’anions et une faible proportion (7 à 10%) essentiellement constitué d’immunoglobuline est sous forme cationique et s’absorbe sur échangeur de cations.

Intérêts des CPL dans les IAA Haute valeur nutritionnelle Richesse en acides aminés essentiels (Lys + Thr…) Neutralité de goût Intérêt des protéines du lactosérum : elles ont tout d’abord un intérêt considérable du fait de leur très haute valeur nutritionnelle. Leur composition en acides aminés essentiels est très riche, notament en lysine et en trytophane. Elles sont solubles dans l’eau, où elles forment des solutions colloïdales parfaites à des concentrations allant jusqu’à 25%. Elles sont neutres au niveau du goût, et donc beaucoup plus agréables pour la consommation que les caséines et caséinates. Leur couleur peut varier de blanc à crème, selon la nature du lactosérum utilisé. Elles ont aussi des propriétés fonctionnelles très intéréssantes : - pouvoir émulsifiant en présence de matière grasse - pouvoir gélifiant par coagulation à la chaleur - pouvoir moussant Couleur Propriétés fonctionnelles intéressantes

Propriétés fonctionnelles des CPL Définition Interaction protéine-eau Interactions protéine-protéine Les propriétés fonctionnelles des protéines résultent de l’ensemble des propriétés physico-chimiques et structurales du composé, lesquelles dépendent de son environnement (pH, température, force ionique, nature des ions, concentration, etc…) ainsi que de certains effets dus au procédé (modification physique, chimique, enzymatique, agitation, mélange, réfrigération, chauffage, pompage, entreposage, etc…). Les caractéristiques physico-chimique d’une protéine sont le poids moléculaire, la composition et la distribution des acides aminés, la conformation, la charge nette de surface. D’après cheftel et al., les propriétés fonctionnelles des protéines peuvent être classées en 3 groupes principaux : - les propriétés dépendant des interactions protéine-eau (absorption et rétention d’eau, mouillabilité, gonflement, adhésion, dispersibilité, solubilité et viscosité) - les propriétés dépendant des interactions protéine-protéine (précipitation, gélification) - les propriétés de surface (propriétés emulsifiantes et moussantes) Certaines de ces propriétés existent déjà naturellement ou s’acquièrent ou sont améliorées au cours des traitements technologiques que nous avons vu précédemment. Propriétés de surface Émulsifiant Moussant / Foisonnant

Interactions protéine - eau Solubilité / dispersibilité Solutions colloïdales parfaites jusqu’à 25 % Très solubles dans une zone étendue de pH et de force ionique La solubilité sur toute l’échelle de pH et la capacité de rétention d’eau sont les propriétés fonctionnelles les plus remarquables des protéines du lactosérum. Par exemple d’après une étude scientifique la poudre de lactosérum doux peut absorber 3,9 g d’eau par g de protéine contre 2,6 et 3g d’eau par g de protéine pour les caséinates de sodium et de calcium, respectivement. De cette capacité de lier et structurer l’eau découlent des propriétés fondamentales pour l’industrie alimentaire, tant au plan technologique (bon déroulement des processus enzymatiques) qu’au plan économique (conservation de l’eau tout au long de la chaîne de production et de commercialisation). Les variations de composition des protéines du lactosérum entre elles leur confèrent des différences au niveau de leurs propriétés fonctionnelles. Rétention d’eau Rétention  quand pH  (4-10)

Interaction protéine-protéine Gélification Pré-traitement thermique indispensable (coagulation) Influence du pH et de la force ionique b-lactoglobuline (g.L-1) NaCl (mol.L-1) 0.02 0.06 0.10

Propriétés de surface Protéines amphiphiles Déploiement partiel => Orientation à l’interface air/liquide ou huile/eau Pouvoir émulsifiant Protéines = molécules tensio-actives =>Stabilisation des émulsions Le caractère amphiphile des protéines laitières leur permet de s’orienter à l’interface huile-eau ou air-eau et d’abaisser la tension de surface. Par exemple, dans une émulsion ou une mousse, les protéines vont migrer vers l’interface, où elles vont former un film et perdre une partie de leur énergie de conformation et d’hydratation, d’où une diminution de la tension de surface. La stabilité du système va être fortement dépendante de la nature et des propriétés du film Pouvoir moussant Pouvoir moussant comparable à celui du blanc d’œuf

Utilisation dans les IAA Critères d’acceptation d’un ingrédient alimentaire protéique Bonnes propriétés fonctionnelles et nutritionnelles Concentration protéique élevée Résistance aux traitements technologiques Compatibilité Sans saveur ni pigments indésirables Coût faible, reproductibilité de la production Protéines sériques répondent à ces critères

Secteurs d’utilisation Produits laitiers Crèmes glacées Sauces Potages Pâtisseries, biscuiteries, panification Charcuterie

Intérêts des protéines solubles dans les IAA Secteur Produit Propriétés recherchées Chocolaterie Pâte à tartiner émulsion Glaces Crèmes glacées Émulsion, retardement de la fonte, répartition homogène des arômes, gélification/stabilité Panification Pains spéciaux Coloration, ralentissement du rassissement Biscuiterie Céréales petit dej’ Friabilité, croustillance, rétention eau Sauces, Potages Sauces, potages Émulsion, liant, rétention d’eau Plats cuisinés Appertisés Émulsification, liaison d’eau, cohésion Pâtisserie Tartes, quiches Croustillance de la pâte Charcuterie Surimi Gel, piégeage des arômes Produits laitiers Yaourts Tenue du gel

Utilisation dans le domaine pharmaco-médical Développement de techniques d’hydrolyse et de fractionnement des PLS Nutrition entérale Hydrolyse douce => obtention de petits peptides Obtention de protéines d’intérêts médical - Lactoferrine (750€/kg) - Lactoperoxydase Hydrolyse de la lactalbumine Riche en tryptophane Compléments alimentaires Aliments et boissons énergétiques

Utilisation dans le domaine pharmaco-médical Activité biologique des PLS Protéine Activité probable PLS totales Anti cancérigène Stimule le système immunitaire Réduit le cholestérol Reconstruction fibres musculaires Limitation de la fonte musculaire Béta-lactoglobuline Alpha-lactalbumine Facilite la digestion  Le contrôle de la douleur Anti-cancérigène Lactoferrine Antimicrobien Contrôle le transport du fer Anti-inflammatoire Favorise la croissance des cellules Inhibition des radicaux libres Lactoperoxydase Antibactérien Sérum albumine

La lactoferrine Exemples d’applications de la lactoferrine • Utilisé comme agent nettoyant antibactérien pour la protection de la viande contre des bactéries nocives. • Elle est utilisée dans les laits maternisés • C’est un ingrédient novateur et prometteur pour l’enrichissement en fer dans la supplémentation. • Par sa capacité de fixer le fer, agit comme antioxydant et accroît la durée de conservation des produits contenant du fer. Stimulation des bifidobactéries pour la santé du tube digestif. Détruit Helicobacter pylori

Utilisation en tant que complément alimentaire Whey Protein 90 est le produit optimal pour le développement de la masse musculaire. Le produit est composé de protéines de lactosérum isolées ce qui représente la source de protéine avec la valeur biologique et la teneur en BCAA les plus élevées. Gamme MEDIC-SYSTEM anti-vieillissement, amincissement et libido NUTRILIFE PRO : ACIDES AMINES (L-arginine L-glutamine L-glycine) PROTEINES DU LACTOSERUM par boîte de 20 sachets panachés orange / citron-vanille  MEDIC-SYSTEM 59.50 EUR 

Conclusion Ingrédients alimentaires Valeur nutritionnelle Propriétés fonctionnelles Présents sur les marchés à haute valeur ajoutée Pharmaceutique Diététique Aliment hyper protéiné (régime, musculation)