Dosages spectrométriques La loi de Beer-Lambert titre Notions théoriques associées TP 03

1. Observations. Comme on l’a vu au cours du TP-02, le graphe Abs = f ( C ) est une droite. On pourrait très bien obtenir une droite de ce type. Abs C Elle serait juste, mais les calculs seraient moins pratiques. 1 La droite passe par zéro C’est parce que l’on a étalonné l’appareil. L’absorbance d’une solution est proportionnelle à la concentration du (ou des) soluté qui la colore.

1 y = a . x Abs = e . C . l 2. Le point de vu du mathématicien. Les droites passant par zéro obéissent à une équation du type: Abs C y = valeurs en ordonné Celles qui ne passent pas par zéro obéissent à une autre équation : x = valeurs en abscisse 1 a = coefficient de proportionnalité On lui donne plein de noms parce que c’est une valeur importante: coefficient directeur, pente de la droite,… y = a . X + b On la rencontrera plus tard. Abs = e . C . l Beer-Lambert fut le premier à appliquer cette loi mathématique aux dosages colorimétriques. e = coefficient d’extinction molaire. l = longueur de la cuve. y (en ordonné) -----> Abs x (en abscisse) -----> C e = est en L.mol-1.cm-1 a (coefficient de proportionnalité) -----> e.l

1 y = a . x Abs = e . C . l 2. Le point de vu du biochimiste. Les droites passant par zéro obéissent à une équation du type: Abs C y = valeurs en ordonné x = valeurs en abscisse 1 a = coefficient de proportionnalité On lui donne plein de noms parce que c’est une valeur importante: coefficient directeur, pente de la droite,… Abs = e . C . l e = coefficient d’extinction molaire. l = longueur de la cuve. Beer-Lambert fut le premier à appliquer cette loi mathématique aux dosages colorimétriques. y (en ordonné) -----> Abs x (en abscisse) -----> C a (coefficient de proportionnalité) -----> e.l

1 Abs = e . C . l 2. Le point de vu du biochimiste. e = coefficient d’extinction molaire. l = longueur de la cuve. En pratique, comment utiliser cette droite pour les dosages ? Abs C La nature du soluté. C’est une caractéristique moléculaire. 1 La longueur d’onde utilisée. Ce paramètre dépend de deux facteurs. D’où l’établissement du spectre d’absorption pour définir la longueur d’onde la plus efficace (celle qui est la plus absorbée) Et il est important doser dans la vie. e L’absorbance dépend de trois paramètres. Encore heureux, sinon on ne pourrait pas doser ! La concentration en soluté. La longueur de la cuve. Pour comparer les valeurs, on utilise des cuves de longueur universelle. Pour simplifier les calculs, on choisit 1 cm

1 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). En pratique, la première étape est effectuée par les concepteurs du dosage. Un dosage complet se déroule en trois étapes. Etape 1: Choix de la longueur d’onde. Abs l On établit le spectre d’absorption du soluté à doser. 1 Voir TP 01 Pic d’absorbance l optimale En pratique, la longueur d’onde figure sur le protocole. On passe directement à l’étape 2.

D’où l’intérêt de tracer les graphes intelligemment. 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). D’où l’intérêt de tracer les graphes intelligemment. Un dosage complet se déroule en trois étapes. Etape 2: L’étalonnage. Il existe plusieurs variantes adaptées à des situations différentes. 1 C’est la honte ! La méthode artisanale: la gamme d’étalonnage. On réalise une gamme de solutions de concentrations croissante et on mesure l’absorbance de chacune. Abs C Voir TP 02 Avantages: Une erreur sur un point est compensée par les autres. On trace la droite théorique. inconvénient: C’est lourd et laborieux.

Il existe plusieurs variantes adaptées à des situations différentes. 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). Un dosage complet se déroule en trois étapes. Etape 2: L’étalonnage. Il existe plusieurs variantes adaptées à des situations différentes. 1 Vous utiliserez cette méthode en BTS ABM ou dans le privé. La méthode standardisée: la solution de référence. On utilise cette méthode dans le cas de « coffrets », c’est-à-dire lorsque les réactifs et étalons sont élaborés par le fournisseur. Dans ce cas, on utilise une solution étalon unique. Elle présente aucun intérêt pour l’apprentissage. Avantages: Méthode simple et calculs rapides …et en plus on n’a pas les sous ! inconvénient: C’est cher. La moindre erreur ne pardonne pas.

1 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). Un dosage complet se déroule en trois étapes. Etape 2: L’étalonnage. Il existe plusieurs variantes adaptées à des situations différentes. 1 La méthode fondamentale: Pas d’étalon dans ce cas. Les calculs utilisent directement la loi de Beer-Lambert. Avantages: Méthode simple et calculs rapides Cette méthode, on oublie ! inconvénient: On connaît rarement e. Là encore, la moindre erreur ne pardonne pas.

Il suffit de savoir lire et de manipuler correctement. 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). Pour être comparés, les solutions doivent impérativement être préparée dans les mêmes conditions. Un dosage complet se déroule en trois étapes. La préparation des tubes de la gamme et du dosages se font en même temps. Etape 3: Le dosage. Choisir la dilution appropriée. 1 Préparer les cuves selon le protocole. Il suffit de savoir lire et de manipuler correctement.

1 Abs = e . C . l 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). 3.1. L’interprétation des résultats. Abs = e . C . l S’ils sont réalisé dans les mêmes conditions, tous les cuves obéissent à la même équation de Beer-Lambert. 1 La méthode artisanale: la gamme d’étalonnage. Abs C Les points inconnus obéissent à l’équation et trouvent leur place sur la droite. Abs X La solution a été diluée au cours du dosage. Il faut les prendre en considération pour les calculs qui suivent. Ccuve X

Référence (Standard): 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). 3.1. L’interprétation des résultats. Abs = e . C . l S’ils sont réalisé dans les mêmes conditions, tous les cuves obéissent à la même équation de Beer-Lambert. 1 La méthode standardisée. Référence (Standard): Absréf = e . Créf . l Absréf = e . Créf . l Créf Absx e . Cx . l Cx Inconnu X : Absx = e . Cx . l Cx = Créf . Absx Absréf La solution a été diluée au cours du dosage. Il faut les prendre en considération pour les calculs qui suivent. Cx = Créf . Absx . 1 Absréf D

C’est toujours plus facile avec les formules. 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). 3.1. L’interprétation des résultats. Abs = e . C . l S’ils sont réalisé dans les mêmes conditions, tous les cuves obéissent à la même équation de Beer-Lambert. 1 La méthode fondamentale. Cx = Créf . Absx e . l Absx = e . Cx . l La solution a été diluée au cours du dosage. Il faut les prendre en considération pour les calculs qui suivent. Cx = Absx . 1 e . l D C’est toujours plus facile avec les formules.

1 3. Les dosages spectrométrique (ou colorimétriques). 3.2. Avant ou après dilution ? Les solutions, étalons ou inconnues, subissent une série de dilutions: - Dilutions préliminaires Ces dilutions permettent d’ajuster les concentrations pour qu’elles soient compatibles avec la méthode employée. 1 - Dilutions par les réactifs. Ces dilutions sont identiques pour toutes les cuves. Elles sont dues à l’addition des réactifs pour le développement de la couleur. On verra en rédigeant le compte-rendu qu’il existe deux méthodes de calcul qui tiennent compte ou non de cette dernière dilution.