PROPRIÉTÉS DES ACIDES AMINES

1-1Propriétés ioniques:

Ionisation d’un acide aminé:

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 8 Titrage des acides aminés 1. scénario le plus simple: pI = point isoélectrique= pH où 100% zwitterion pI = pKa1 + pKa2 2 La fraction de groupe COOH ou NH 2 qui est chargé à un pH donné peut être trouvé par l’équation d’Henderson- Hasselbach: pH = pKa + log A - HA Tampon!

pKa1pKa2pKaR Quel est le pI du glutamate? NaOH pH pKa1 pKaR pKa % A 100% B 100% C 100% D ABCD

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.11 Structure des 20 acides aminés 5. Acides aminés chargés positivement:His pKaR pKa2

Propriétes Spectrales:Absorption des rayonnements UV Aucun AA n’ absorbent la lumière visible. Certains absorbent la lumière UV : ce sont tous des AA aromatiques. Ce sont les doubles liaisons conjuguées des cycles aromatiques qui sont responsable de l’absorption. Les absorptions à une longueur d’onde inférieure à 250 nm sont non spécifiques car de nombreuses molécules absorbent à ces mêmes longueurs d’onde. Chromophore : c’est une molécule qui absorbe la lumière (visible ou UV)

Propriétés physiques: 2.1.Solubilité dans l’eau Ils sont tous solubles dans l’eau, avec des différences selon la nature de R. · R ionisable : très soluble · R non ionisable : soluble · R apolaire : moins soluble La solubilité dépend du pH : minimal au point isoélectrique (pHi) pHi : c’est le pH auquel la charge net de la molécule est égale à 0, donc elle porte autant de charge positive que négative.

2.2.Solubilité dans les solvants organiques Elle est plutôt faible en général. Elle est aussi différente suivant le R des AA. On l’utilise pour identifier les AA, par la séparation sur solvant, de la méthode de la chromatographie.

Les agents physiques La température supérieur à 45°C : rupture des liaisons hydrogène (thermo coagulation de l’albumine du blanc d’œuf Les ultrasons (toutes les liaisons sont affectées) Les ultraviolets (toutes les liaisons sont affectées) · Variation brutale du pH è réaction irréversible

Les agents chimiques Les acides et lesmétauxlourds modifications irréversibles (précipitation, coagulation…) Les milieux fortement concentrés en sels, à force ionique élevée : ils ont un effet de relargage. Les sels captent les molécules d’eau qui,normalement, participent à la solubilité des protéines. Le manque d’eau force les protéines à exposer leurs AA hydrophobes en surface, permettant ainsi les contacts hydrophobes entre protéines, qui agglutinent et précipitent. Onpeut utiliser la précipitation sélective pour séparer différentes protéines. C’est un phénomène réversible, donc très utilisé.

PROPRIETES CHIMIQUES

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 32 Analyse des acides aminés 2. Détection des acides aminés Alors qu’on peut détecter Trp, Phe et Tyr grâce à leur A nm, c’est impossible pour les autres acides aminés; La ninhydrine réagit avec le groupe amine des acides aminés, générant un produite de couleur pourpre (jaune dans le cas de Pro). La réaction à la ninhydrine permet alors de détecter et quantifier (A 570nm ) les acides aminés éluant des fractions lors de la chromatographie par échange d’ions. O O OH Ninhydrine Acide aminé 2 O O N O O C H R COO - NH 3 + CO 2 Pourpre!! R-HC=O

PEPTIDES La liaison peptidique définition C’est une liaison covalente qui s’établit par condensation entre le groupement carboxylique d’un AA et le groupement amine du suivant :

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.55 Conformation du groupe peptidique Si la liaison peptidique est planaire, alors, les deux atomes impliqués dans la liaison peptidique ainsi que les quatre substituants (l’oxygene carbonyle, l’hydrogene amide, et les deux carbones α adjacents) qui forment le groupe peptidique sont co-planaires Groupe peptidique

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.56 Peptides - nomenclature On utilise différentes façons pour écrire un polypeptide (trait d’union = lien peptidique) : – Tyrosyl-glycyl-glycyl-phénylalanyl-leucine – Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu – Y-G-G-F-L – YGGFL Notez que le peptide est toujours écrit avec le N-ter à gauche et le C-ter à droite (NH 2  COOH).

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 57 Peptide: hydrolyse La composition (et NON PAS la séquence) en acide aminés d’un peptide est déterminée en hydrolysant tout d’abord le peptide: – Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu  Gly 2, Leu, Phe, Tyr Les acides aminés sont alors purifiés par chromatographie échangeuse d’ions, quantifiés par la réaction avec la ninhydrine, puis identifiés par chromatographie sur couche mince; 6 M HCl

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 58 Chromatographie sur couche mince (TLC) Le mélange d’acides aminés inconnus est tout d’abord déposé au bas d’une plaque de silice. Des échantillons connus d’acides aminés sont aussi appliqués à côté du mélange inconnu; La plaque est ensuite trempée dans un solvant, qui migrera lentement vers le haut de la plaque par capillarité; Les acides aminés migreront aussi le long de la plaque, selon leur degré de solubilité dans le solvant: – très soluble: migre rapidement – Solubilité intermédiaire: migration intermédiaire; – Faible solubilité: migration lente. Les acides aminés sont ensuite visualisés en vaporisant de la ninhydrine sur la plaque; En comparant la mobilité relative (R F ) des acides aminés du mélange avec les acides aminés connus, on peut identifier les acides aminés du mélange. Front du solvant XFXF Ligne de départ XBXB R F = X B / X F

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 59 Analyse des acides aminés 1. Chromatographie à échange d’ions Il existe différents types de résines échangeuses d’ions:  Échange de cations: chargée négativement/séparation de cations  Échange d’anions: chargée positivement/séparation d’anions. Évidemment, le type de résine à utiliser dépendra de la charge de l’acide aminé, ce qui dépend à son tour du pH de la solution. Élution + + pH >> pI pH << pI

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 60 Analyse des acides aminés 2. Détection des acides aminés Alors qu’on peut détecter Trp, Phe et Tyr grâce à leur A nm, c’est impossible pour les autres acides aminés; La ninhydrine réagit avec le groupe amine des acides aminés, générant un produite de couleur pourpre (jaune dans le cas de Pro). La réaction à la ninhydrine permet alors de détecter et quantifier (A 570nm ) les acides aminés éluant des fractions lors de la chromatographie par échange d’ions. O O OH Ninhydrine Acide aminé 2 O O N O O C H R COO - NH 3 + CO 2 Pourpre!! R-HC=O

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 61 Exemples de peptides 1. Aspartame: sucre artificiel 2. Ocytocine: stimule les contractions utérines Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH 2 Résidu de glycinamide: 2 HN-CH 2 -CONH 2 SS Pont disulfure H 3 N + -CH-C-NH-CH-C-OCH 3 COO - CH 2 O O Asp-Phe-methyl ester

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 62 Exemples de peptides 3.Insuline Pont disulfure intrachaîne Pont disulfure interchaîne

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 63 Niveaux d’organisation des protéines Quatre niveaux d’organisation caractérisent la structure des protéines  Structure primaire  Structure secondaire  Structure tertiaire  Structure quaternaire

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.65 Structure primaire Correspond à la séquence d’acide aminés formant la chaine polypeptidique ; La structure primaire est une description complète de toutes les liaisons covalentes dans une chaîne polypeptidique ou de la protéine; Pour certaines protéines, la chaîne polypeptidique est liée par des ponts disulfures; Par contre, aucune indication n’est donnée quant à la position des acides aminés dans l’espace

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.67 Structure secondaire Réfère à la structure spatiale adoptée par des acides aminés adjacents sur une portion seulement de la protéine; Les liaisons hydrogène jouent un rôle important pour stabiliser les conformations de structures secondaires; Les deux types principaux de structure secondaire sont: l’hélice alpha et le feuillet bêta;

c-COLLAGENE Le collagène est très répandu dans le règne animal. C’est la principale protéine des tissus conjonctifs et du squelette des vertébrés. Le collagène forme des fibrilles qui résistent à la traction. La molécule de collagène est constituée de 3 chaînes peptidiques, dont deux au moins sont les mêmes dans tous les différents collagènes. Ce sont des cylindres d’environ 3 x 1000 acides aminés, de 280 nm de longueur et 1,4 nm de diamètre, avec une masse moléculaire proche de 300 kDa.

09/17/9815PAA 1140 Biochimie vétériaire Cours 8 Structure primaire du collagène

09/17/9816PAA 1140 Biochimie vétériaire Cours 8 Collagène Les trois chaînes  du collagène

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.77 Structure tertiaire Correspond a l’arrangement spatial de l’ensemble de la protéine; Formée de l’ensemble des structures secondaires adoptée par les différentes régions de la protéine; Formée par une chaine polypeptidique seulement;

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 79 La formation des différents niveaux supérieurs (2°, 3° and 4°) d’organisation se fait de manière précise; Une protéine adopte généralement une seule structure tertiaire parmi les très nombreuses conformations possibles: c’est ce qu’on appelle la conformation native de la protéine; Pour maintenir la conformation native, plusieurs forces faibles non-covalentes sont requises.

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.80 Quelles forces déterminent la structure? Structure primaire: – Liaisons covalentes; Structure secondaire: – Les liaisons d’hydrogène des groupes peptidiques prédominent; Structure tertiaire et quaternaire: – Liaisons hydrogène des groupes R – Interactions ioniques – Interactions van der Waals – Interactions hydrophobiques.

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.87 Structure quaternaire Caractérisée par l’association de plusieurs chaînes polypeptidiques (identiques ou différentes), formant une protéine particulière (example: hémoglobine); La majorité des protéines ayant une masse moléculaire plus élevée que Da consistent de 2 monomères ou plus liés de façon non-covalente;

09/17/989PAA 1140 Biochimie vétérinaire, cours10 Structure quaternaire

CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 91 Propriétés générales des protéines 5. Les protéines adoptent une forme bien précise. Chaque polypeptide adopte une forme ou conformation précise. Cette conformation est unique à chaque polypeptide; Une protéine qui adopte la bonne conformation est dite native; Toute altération de la conformation d’une protéine (p.ex. par chauffage) dénature la protéine et mène généralement à son inactivation. Protéine globulaire Protéine filamenteuse (ou en bâtonnets)

-Détermination de la composition en Acides Aminés * Hydrolyse acide : résultat. % d’ Acides Aminés pour 100g ou nombre de mole/mole de protéine. *Hydrolyse alcaline Soude 3 N. pour évaluer tryptophane. Chromatographie * Séparation des Acides Aminés Electrophorèse.

*Détermination des extrémités. Réduction Na BH 4 C terminale Carboxypeptidique. N terminale Dansylation (chl de Dansyle) Sanger (DNFB) Edman (Ph.thioisocyanate) Leucine aminopeptidase

Etude de la Structure primaire : *Méthode chimique Action du BrCN : Spécifique de Met. *Méthodes enzymatiques Trypsine après carboxyle de Lys Arg Chymotrypsine des A A aromatiques Phe – Tyr – Trp Thermolysine avant amine de Leu – lleu – Val pepsine – papaïne peu de spécificité

Combinaison des étapes → séquence. T C Thermo C T BrCN H2N-Gly-Arg-Tyr-Ala-Leu-Phe-Lys-Ser--Met- Hist-Pro-Asp COOH

Autre Méthode Génie génétique - Séquence de 25 Acides Aminés N terminal. - Synthèse du m RNA (poly nucléotide phosphorylase). - marquage du mRNA. Hybridation moléculaire au DNA. - Séquence du DNA → séquence de protéines