Risques toxiques pour la santé L3 – Biologie Humaine et Technologies de la Santé Risques toxiques pour la santé Erwan STÉPHAN-BLANCHARD

Plan Éléments de toxicologie Toxicocinétique et toxicodynamique Investigations toxicologiques Toxicité de fonction Système cardiovasculaire Système respiratoire Système nerveux Étiologie : principaux toxiques et effets

Éléments de toxicologie

Histoire Étymologie (grec) Histoire Toxicon = poison Logos = étude, science Histoire Cléopâtre (69-30 av JC) Suicide par vipère aspic F. Magendie (1783-1855) Pharmacotoxicologie expérimentale Socrate (470-399 av JC) Exécuté par cigüe Paracelse (1493-1541) Vers la toxicologie moderne WW2 : gaz de combat Toxicologie moderne

Toxicologie Toxicologie : science qui étudie les toxiques ou poisons Le toxique Origine propriétés physiques, chimiques et biologiques Biotransformations, devenir (toxicocinétique) leurs mécanismes d’action sur les systèmes vivants (toxicodynamique) leur détection et leur quantification les moyens de combattre leurs actions nocives par la mise en oeuvre de thérapeutiques et de mesures de prévention

Toxicologie (2) S’intéresse particulièrement à l’identification du danger et à l’analyse du risque lié à l’exposition des organismes vivants aux xénobiotiques développe et utilise des modèles expérimentaux moléculaires, cellulaires et intégrés ainsi que des modèles bio-informatiques. but : définir la sécurité sanitaire des populations

Toxicité Toxicité : capacité des substances à provoquer un dysfonctionnement au niveau cellulaire, moléculaire, organique. La toxicité d’une substance est f() de : L’organisme cible Espèce Ethnie Age, sexe, poids État de santé, fatigue, facteurs physiologiques,…

Toxicité (2) La substance L’environnement: T°, altitude, saisons… Voie d’entrée : cutanée, respiratoire, digestive Rapidité et durée d’administration Concentration : seuils d’effet, dose toxique Propriétés physico-chimiques : solubilité, ionisation, taille Volatilité Véhicule associé Biotransformations (détoxification, toxification) L’environnement: T°, altitude, saisons… Des interactions entre substances.

Modèles d’interaction Synergie additive => effet global = somme des effets de chaque substance renforçatrice => effet > somme des effets de chaque substance (potentialisation) Antagonisme : réduit la toxicité de la substance Chimique Fonctionnel Compétitif : même récepteur Non compétitif: pas le même récepteur

Toxicocinétique

Définition Étude descriptive et quantitative du devenir des toxiques dans l'organisme Ce n'est pas la dose mais la concentration au niveau du ou des site(s) d'action qui détermine la toxicité Devenir du xénobiotique : 4 étapes Absorption Distribution Métabolisme Excrétion

Absorption Passage du xénobiotique du site d'administration jusqu'à la circulation systémique Principaux déterminants : Caractéristiques de la voie d’entrée Concentration de la substance à la porte d’entrée Propriétés physico-chimiques de la substance

Absorption (2) Pour accéder à la circulation systémique, le toxique doit passer à travers les membranes biologiques Nature chimique du composé conditionne son absorption: Pour traverser les membranes, le xénobiotique doit présenter une certaine liposolubilité Seule la fraction non ionisée (donc liposoluble) est capable de passer les membranes biologiques

Systèmes de transport membranaire Mécanismes Énergie Molécules Diffusion passive Sens gradient [] Lipophiles Filtration Sens gradient p° Lipophiles PM<100 Diffusion facilitée Sens gradient [] Ligands transporteurs Métabolisme Contre gradient [] Transport actif Ligands transporteurs Pinocytose, phagocytose Métabolisme PM élevé

Voies d’absorption Un toxique peut pénétrer dans l'organisme par différentes voies: voie orale voie pulmonaire voie cutanée voies mineures : absorption sous-cutanée absorption intramusculaire voie intraveineuse (pas absorption)

La voie digestive

La voie digestive (2) Voie d'entrée fréquente pour les toxiques (médicaments, aliments contaminés, tentatives de suicide, accidents domestiques...) Absorption en général par diffusion passive sur toute la longueur du tube digestif (cavité buccale -> colon). Parfois : transporteur, pinocytose

Principaux sites de résorption Bouche, oesophage : peu d’absorption faible temps de contact exceptions : nicotine, dérivés nitrés, … Estomac (pH 1-3) : faible surface acides organiques faibles et petites molécules hydrosolubles Intestin (pH 5-8) : surface d’échange (300 m²) et temps de contact importants bases faibles, acides faibles

Facteurs influençant l’absorption Liés au tube digestif Surface d’absorption Cavité buccale : 0,02 m² Estomac : 0,1 à 0,2 m² Intestin grêle : 300 m² Gros intestin : 0,5 à 1 m² Rectum : 0,04 à 0,07 m² Acidité de l'estomac -> hydrolyse de certains composés Cycle entéro-hépatique

Facteurs influençant l’absorption (2) Enzymes et flore bactérienne impliquées dans la digestion Motilité (↑ du temps de résidence -> ↑ de l'absorption) Vitesse de la vidange gastrique Liés au xénobiotique vitesse de dissolution Liposolubilité Ex : Indiens d’Amérique du Sud mangent les animaux tués avec du curare (hydrophile => non absorbé)

ADME d’un xénobiotique

La voie pulmonaire

La voie pulmonaire (2) Voie de pénétration fréquemment impliquée Absorption très rapide: vaste surface d'échange alvéolaire (70 – 80 m²) très forte perméabilité de l'épithélium (très fin) tissu fortement vascularisé Sont absorbés au niveau pulmonaire: des gaz (CO, oxydes d'azote, gaz de combat…) des vapeurs de liquides volatils (benzène, CCl4...) des aérosols et des particules atmosphériques

Cas des gaz et vapeurs Certains gaz inhalés sont au moins partiellement retenus par le mucus de la muqueuse nasale (ex : formol) Les molécules gazeuses sont sous forme non ionisée et l'épithélium alvéolaire est très fin: diffusion très rapide de l'espace alvéolaire vers le sang le gaz se dissout dans le sang (atteinte d'un équilibre air alvéolaire/sang) et se distribue facteur essentiel : solubilité du gaz dans le sang

Cas des gaz et vapeurs (2) Éthylène Chloroforme Solubilité + +++ Absorption Lente Rapide Équilibre 10 – 20 min 1 h

Cas des aérosols et particules Aérosols = ensemble de particules solides ou liquides en suspension (si vit. limite maxi < 0,25m.s-1) dans un milieu gazeux La quantité et la localisation du matériel déposé dans l’arbre respiratoire dépend des propriétés physiques (diamètre, densité, charge,...) des particules inhalées des caractéristiques anatomiques et physiologiques des sujets. La zone de dépôt (fraction inhalée) des particules dépend du Diamètre aérodynamique (Daé)

Fractions inhalables Fraction inhalable et sous fractions Fraction extra thoracique : fraction inhalée qui ne pénètre pas au-delà du larynx Fraction thoracique (arbre trachéo-bronchique) : % de fraction inhalable avec Daé médian = 10 µm Fraction alvéolaire (respirable) : zones d’échanges (bronchioles, alvéoles) % de la fraction inhalable Daé médian = 4 µm

Fractions inhalables (2)

Zones de déposition Dépôt muqueuse nasale Déglutition et éternuement Dépôt bronches et bronchioles Mouvements ciliaires Phagocytose Ex : suie, silice Petites particules (hydrosolubles, PM < 10000) Macrophages alvéolaires Ex : particules diesel

ADME d’un xénobiotique

La voie percutanée

La voie percutanée (2) Stratum corneum (couche cornée épaisse) : barrière relativement infranchissable. Les autres couches de l'épiderme et du derme constituent des barrières moins sélectives. Absorption via les follicules pileux, les cellules des glandes sudoripares ou des glandes sébacées (rapide mais peu importante) Passage par diffusion passive Molécules lipophiles de faible PM

La voie percutanée (3) Certains facteurs modifient la perméabilité: dermatoses Brûlures, inflammation hydratation cutanée acides, bases, gaz moutardes Certains toxiques (organo-chlorés, organo-phosphorés) s'accumulent dans l'épiderme et sont lentement libérés dans l'organisme Une exposition cutanée peut conduire à une intoxication systémique (diméthylformamide, gaz de combat…)

ADME d’un xénobiotique

Distribution Passage des toxiques de la circulation générale vers les tissus et les organes (effets toxiques, accumulation) Ces phénomènes dépendent: du débit sanguin de l'organe ou du tissu concernés de la capacité à diffuser hors du capillaire vers les cellules de l'organe ou du tissu concernés de l'affinité du toxique pour les protéines plasmatiques et tissulaires Mécanismes: diffusion passive transport actif

Distribution (2) Cible de la distribution = cible du toxique? Le stockage peut : ne pas entraîner de conséquences toxicologiques -> sites non spécifiques Ex : Plomb / os correspondre à la cible -> sites spécifiques Ex : paraquat / poumons Il existe un équilibre entre la fraction stockée et la fraction libre circulante. Plus le toxique est métabolisé et excrété plus il est quitte facilement son site de stockage

Distribution (3) Fixation aux protéines plasmatiques : albumine (très nombreux xénobiotiques) α1-glycoprotéine acide (composés basiques) autres lipoprotéines (composés liposoluble) transferrine (fer) ceruloplasmine (cuivre) γ-globulines (antigènes) Risques de compétition

Distribution (4)

Accumulation tissulaire Foie et reins accumulation importante protéines ayant une affinité particulière pour certains toxiques Ex : métallothionéine (forte affinité avec métaux tels que le Cadmium, Plomb, Zinc) Graisses accumulation de composés lipophiles (ex : insecticides) possibilité de relargage ultérieur (jeûne)

Accumulation tissulaire (2) Tissu osseux stockage de toxiques particuliers F-/OH- Pb++/Ca++ Barrière hémato-encéphalique : les cellules de l'endothélium capillaire sont étroitement jointives, seuls les composés très liposolubles la franchissent Barrière hémato-placentaire: relativement efficace sauf vis à vis des toxiques très liposolubles

ADME d’un xénobiotique

Métabolisation Principaux sites : foie +++, rein, poumons Objectif de la métabolisation : transformation d’une substance liposoluble en substance hydrosoluble plus facilement éliminable. Les métabolites peuvent avoir une toxicité différente de la substance initiale Métabolisme inactivateur : xénobiotique -> transformation enzymatique -> métabolite inactif Métabolisme activateur -> métabolite actif stable ou instable Métabolisme absent

Métabolisme des xénobiotiques Il existe 3 phases de biotransformation enzymatique : Phase I : fonctionnalisation Phase II : conjugaison Phase III : exclusion cellulaire

Phase I : fonctionnalisation Enzymes de phase I réactions de fonctionnalisation Addition d’un groupement fonctionnel (OH, NH2, COOH…), cible des enzymes de phase II Différents mécanismes de fonctionnalisation Oxydation (perte d’électrons) Réduction (gain d’électrons) Hydrolyse

Réactions d’oxydation Nombreuses réactions Mono-oxygénases (cytochromes P450) Cyclo-oxygénases Déshydrogénases Peroxydases Parfois mènent à des composés instables

Réactions de réduction Peu nombreuses Principalement en milieu anaérobie Surtout flore bactérienne intestinale Il s’agit le plus souvent d’une réduction de composés polyhalogénés et de dérivés nitrés par des réductases. R-N=N-X -> R-NH2 + NH2-X CCl4 -> CHCl3 Parfois, produit des composés instables Ex : trétrachlorure de carbone

Réactions d’hydrolyse Réactions d’hydrolyse très nombreuses Principales enzymes : Estérases Protéases Peptidases Aminases Parfois, conduisent à des composés très toxiques Ex : dégradation phénacétine -> phénétidine (néphrotoxique)

Phase II : conjugaison Enzymes de conjugaison : ajoutent un groupement polaire d'origine endogène à un groupement fonctionnel de la substance ou de ses métabolites. X-OH + R-OH -> X-O-R (très hydrophile, moins réactif) ↑ caractère hydrophile ↑ excrétion plus rapide que réaction de phase I

Phase II : conjugaison (2) Différentes enzymes ou réactions de phase II Glycuro-conjugaison (UDP-Glucuronyl-Transférases) Sulfo-conjugaison (Sulfotransférases) Conjugaison au glutathion (glutathion S-transférases) Conjugaison aux acides aminés (glycine, taurine, acide glutamique) Réactions de méthylation (Méthyl Tansférases) La synthèse de la molécule endogène polaire nécessite de l'énergie -> voie métabolique saturable

Réactions de conjugaison

Synthèse du métabolisme

Facteurs influençant le métabolisme Age Génétique (polyporphisme du CYP450) Carences nutritionnelles Induction enzymatique Ex : CYP450 avec éthanol, HAP, phénobarbital, jus de pamplemousse Inhibition enzymatique Dose et concentration du xénobiotique

Excrétion Tout processus réduisant la quantité du toxique dans l’organisme Voies d’élimination : Rénale (urinaire) +++ -> substances hydrosolubles Digestive (fèces) -> substances liposolubles Respiratoire Autres voies Lait : substances basiques et liposolubles (DDT, dioxines…) Phanères et salive (intérêt analytique) Sueur, larmes

Définitions Clairance : quantité de toxique éliminée par unité de temps. Demi-vie d’élimination : temps nécessaire pour que la concentration sanguine du toxique diminue de moitié.

Épuration pulmonaire Dépôt et rétention des particules minérales et organiques Épuration trachéo-bronchique rapide par clairance muco-ciliaire Battement des cils synchrone (17 à 25 batt./s) qui acheminent le mucus vers les VAS Le mucus : contient des glycoprotéines et recouvre les voies respiratoires des bronchioles terminales aux VAS Toux : moyen important d’épuration si l’épuration muco-ciliaire est déficient (bronchite chronique)

L’auto-épuration

Élimination par voie digestive Élimination directe = excrétion intestinale Élimination si forme ionisée au pH intestinal (pH=5,3) Passage de la substance du sang vers les intestins selon gradient de concentration Sécrétions intestinales Élimination lente

Élimination par voie digestive (2) Excrétion biliaire Rôle majeur dans l’excrétion fécale De nombreux métabolites sont éliminés dans la bile Transport actif, principalement des grosses molécules Cycle entéro-hépatique Durée d’élimination allongée Toxicité augmentée Applications thérapeutiques

Vascularisation hépatique

Cycle entéro-hépatique Premier passage hépatique : Tous les vaisseaux irriguant le tractus gastro-intestinal (sauf bouche, pharynx et rectum) mènent au foie (via veine porte) Xénobiotiques absorbés po subissent 1er passage hépatique : stockage métabolisation libération dans la bile (élimination fécale) ou la circulation générale Cycle entéro-hépatique : Pour substances excrétées dans la bile et réabsorbées au niveau intestinal -> élimination ralentie

Élimination rénale La plupart des toxiques sont éliminés par les reins Les toxiques présentant un coefficient de partage lipide/eau élevé sont réabsorbés, du moins en partie Les composés polaires ou ionisés sont facilement éliminés dans l'urine: Bases : excrétion ↑ si pH urinaire ↓ Acides : excrétion ↑ si pH urinaire ↑ Transport actif transporteurs d'anions organiques (acides) transporteurs de cations organiques (bases) possibilité de compétition (ex: pénicilline/probénécide)

Élimination urinaire : le rein

Unité fonctionnelle : le néphron

Mécanismes d’excrétion rénale La filtration glomérulaire Ultra-filtration du plasma sanguin -> urine primitive (ultra-filtrat, 180 l/jour) Barrière de taille : filtre les molécules avec PM > 70 kD Barrière de charge : filtre les anions La sécrétion tubulaire active Principalement par le TCP Sécrétion par transporteurs actifs +++ La réabsorption tubulaire TCP + TCD + tube collecteur Diffusion passive +++

Facteurs influençant l’excrétion rénale pH urinaire : inhibition de la résorption tubulaire des acides faibles en milieu basique => Élimination +++ Ex : aspirine (diurèse alcaline) Caractéristiques physico-chimiques du toxique Poids moléculaire Polarité (hydrosolubilité) Degré d’ionisation

ADME d’un xénobiotique

Toxicodynamique

Toxicodynamique Toxicodynamique : connaître les mécanismes d’actions des toxiques sur les systèmes vivants Comprendre et connaître la physiopathologie d’une intoxication Produits de bio-activation toxiques Cibles du toxique : atteintes moléculaires, cellulaires, tissulaires Conséquences : dysfonctionnements (inhibition ou stimulation), destruction (nécroses) Objectifs : soigner (antidote), prévenir…

Notion de toxique ultime Toxique ultime : espèce chimique active produisant les effets délétères, à partir Du toxique directement De composés parents (protoxiques) : acides et bases fortes, métaux lourds (Pb), dioxine… De produits de bio-activation Métabolites : Ex. amygdaline -> HCN Espèces réactives de l’oxygène (OH°, radical hydroxyle)

Produits de bio-activation toxiques : les électrophiles Les électrophiles : molécules de charge positive partielle (non ioniques) ou totale (cations) contenant un atome déficient en e- Formation : Soit au cours de la phase I de fonctionnalisation. Le plus souvent oxydation par CYP450 Ex : paracétamol, B[a]P Parfois au cours de la phase II de conjugaison

Exemples d’électrophiles Métabolite électrophile Toxique parent Formulation Électrophiles non ioniques Aldéhyde Éthanol Quinones Paracétamol Epoxydes Benzo[a]pyrène Électrophiles cationiques Ion carbonium Diméthylbenzanthracène Ion nitrénium Acétylaminofluorène

Effets moléculaires des électrophiles Les électrophiles forment des liaisons covalentes avec les atomes nucléophiles (attirés par les espèces chargées positivement) des macromolécules Protéines : atomes S ou N (groupements –SH ou –NH2) Acides nucléiques (ADN et ARN) : atomes N ou O (bases puriques et pyrimidiques) Le niveau de réactivité des électrophiles détermine leurs cibles (pas de spécificité)

Les radicaux libres Définitions : espèces chimiques (molécules, atomes) contenant un ou plusieurs e- non appariés (célibataires) sur la couche périphérique. Il existe 3 mécanismes de formation des RL : Cassure d’une liaison covalente : A-B -> A° + B° Ex : tétrachlorure de carbone CYP450 CCl4 [CCl3°] CHCl3 Tétrachlorure de carbone Radical trichlorométhyl Chloroforme

Les radicaux libres (2) Oxydation des nucléophiles par des peroxydases Ex : phénols Réduction principalement par voie enzymatique (réductases) Ex : paraquat (herbicide), doxorubicine (anti-cancéreux) PQ++ DR NADPH CYP450 réductase PQ°+ DR°-

Les espèces réactives de l’oxygène EROs : espèces chimiques (moléculaires ou radicalaires) Formées par 4 réductions successives de l’oxygène moléculaire en eau Espèces très réactives, plus toxiques que le dioxygène

Formation des EROs Dioxygène Anion (radical) superoxyde Peroxyde d’hydrogène Radical hydroxyle (le plus puissant oxydant connu)

Formation de l’anion superoxyde Formation de O2°- : réduction de l’O2 Sources endogènes : principalement des e- issus de la chaîne respiratoire mitochondriale Sources exogènes (toxiques) : e- apportés dans cycle redox de l’O2 par radicaux libres

Formation du peroxyde d’hydrogène Formation de H2O2 : dismutation de O2°- Dismutation : Oxydoréduction entre 2 molécules de même nature Réaction spontanée ou catalysée par les superoxyde dismutases (SOD) +/- SOD 2O2°- + 2H+ H2O2 + O2

Formation du radical hydroxyle Formation de OH° : dégradation de H2O2 par la réaction de Haber-Weiss (cyclique) Réaction de Fenton : scission homolytique de H2O2 catalysée par des métaux de transition (Fe2+, Cu+) Réduction du Fe3+ par l’anion superoxyde

Synthèse de la formation des EROs

Effets moléculaires des RL et EROs Stress oxydant : résultat d’un déséquilibre de la balance entre pro-oxydants (RL, EROs) et les systèmes de protection (enzymatique et non-enzymatique) => Effets toxiques sur les macromolécules : lipides, protéines, acides nucléiques

Effets moléculaires des RL et EROs (2) Déshydrogénation : perte d’atomes H d’un alcane pour donner un alcène Acides gras -> radicaux lipidiques Protéines -> pontages ADN -> cassures des brins Formation de liaisons covalentes Lipides ADN

Atteintes moléculaires : modification de fonctions Toxiques forment des liaisons avec macromolécules (protéines le + souvent) et modifient leur fonction Activation de protéines : toxiques mimant les ligands endogènes Ex : morphine -> agoniste des récepteurs aux opiacés (neurotransmetteurs : endorphines) dioxine -> active les récepteurs aux hydrocarbures aromatiques Intoxication dioxine

Atteintes moléculaires : modification de fonctions (2) Inhibition de protéines : le plus souvent Antagonistes de récepteurs à des neurotransmetteurs (Ex : atropine, curare) Poisons du cytosquelette (Ex : vincalcaloïdes) Bloqueurs des canaux ioniques (Ex : tétrodotoxine, canal Na+)

Atteintes moléculaires : altérations des protéines Principales altérations des protéines Oxydations La substance toxique forme des ponts entre les chaînes latérales des AA (avec ADN, autres protéines) Fragmentations des liaisons peptidiques Conséquences Pertes de fonction (catalyse, structure…) Dénaturation -> agrégats cellulaires toxiques Formation de néo-antigènes Ex : halothane => hépatites immunes Réparation des protéines par des processus de réduction

Atteintes moléculaires : altérations des lipides Peroxydation lipidique : dégradation peroxydative des lipides membranaires selon un processus radicalaire en 3 étapes Initiation : déshydrogénation des acides gras poly-insaturés -> formation de radicaux lipidiques Propagation : peroxydation -> formation de nouvelles espèces réactives Terminaison : principalement, association de radicaux pour former des composés inactifs

Atteintes moléculaires : altérations des lipides (2)

Atteintes moléculaires : altérations des lipides (3) Conséquences : Destruction des lipides membranaires des cellules Production d’espèces réactives (LOO°, LO°…) qui peuvent se lier à l’ADN et aux protéines Réparation des lipides oxydés : processus de réduction

Atteintes moléculaires : altérations de l’ADN (génotoxicité) Les électrophiles : forment des liaisons covalentes avec atomes nucléophiles de l’ADN (O, N) Formation d’adduits avec N7-guanine Alkylations (méthyl, éthyl…) avec O6 et N7-guanine O6 N7 Guanine

Atteintes moléculaires : altérations de l’ADN (génotoxicité) (2) Les EROs provoquent des liaisons multiples : Pontages inter- ou intra-brins Cassures de brins (simple ou double brin) Oxydations de bases Conséquences : si lésions non réparées => mutation = atteinte génotoxique, 1ère étape du processus de cancérogenèse

Atteintes moléculaires : réparations de l’ADN Réparation de l’ADN Réparation directe : processus enzymatiques pour enlever les groupements rajoutés lors de l’alkylation Excision / réparation Excision de nucléotides en cas de lésions importantes (adduits) Excision de bases en cas de lésions sans distorsion de la double hélice

Atteintes moléculaires : réparation de l’ADN (2)

Atteintes cellulaires : synthèse mitochondriale d’ATP Rôle central de l’ATP dans l’homéostasie cellulaire Source d’énergie : contraction musculaire, pompes membranaires… Substrat de réactions chimiques : phosphorylations… Production d’ATP : phosphorylation oxydative de l’ADP dans les mitochondries

Atteintes cellulaires : synthèse mitochondriale d’ATP (2) 4 groupes de substances toxiques inhibitrices de la production d’ATP selon le site d’inhibition Groupe 1 : inhibiteurs de l’apport de H+ sous forme de co-facteurs réduits (NADH2, FADH2) (Ex : Arsenic) Groupe 2 : inhibiteurs de la chaîne de transport d’e- vers l’O2 (Ex : cyanure) Groupe 3 : inhibiteurs de l’apport d’O2 (Ex : CO) Groupe 4 : inhibiteurs de la phosphorylation de l’ADP par l’ATP synthétase (Ex : DDT)

Atteintes cellulaires : synthèse mitochondriale d’ATP (3)

Atteintes cellulaires : homéostasie calcique Fonctionnement cellulaire normal -> [Ca++]ext = 10 000 x [Ca++]intra Gradient de [Ca++] lié à : L’imperméabilité de la membrane plasmique La présence de transporteurs du Ca++ (cytosol)

Atteintes cellulaires : homéostasie calcique (2) Toxicité de l’homéostasie calcique = augmentation de [Ca++]intra 2 Mécanismes possibles : Stimulation de l’influx = augmentation de l’entrée du Ca++ dans le cytosol Activation de canaux (Ex : glutamate) Formation de pores (Ex : Amphotéricine B) Rupture de membrane (Ex : détergents, lipoperoxydation) Inhibition de l’efflux : réduction de la sortie du Ca++ vers la matrice extra-cellulaire ou les organites (Ex : vanadate)

Atteintes cellulaires : homéostasie calcique (3) Conséquences de l’augmentation de [Ca++]intra Déplétion des sources d’énergie Atteinte du cytosquelette Activation d’enzymes hydrolytiques (nucléases, protéases…)

Atteintes cellulaires : système immunitaire (immunotoxicité) Toxicité par immunosuppression Ex : dioxine Atrophie thymus (glande de la partie inf. du cou, maturation des LT) -> diminution du nombre de cellules corticales Déplétion en LT Augmentation du risque de cancer Toxicité par immunostimulation Ex : tétrachlorométhane (CCl4) Augmentation de la sécrétion de médiateurs de l’inflammation par les cellules de Küpffer (cellules phagocytaires du foie, élimination bactérienne) Augmentation de la toxicité hépatique

Atteintes cellulaires : système immunitaire (immunotoxicité) (2) Toxicité par réaction auto-immune : réaction contre des auto-antigènes Ex : α-méthyl dopa Production d’IgG anti-rhésus Hémolyse chez 10% des patients Toxicité par réaction immuno-allergique : non-dose dépendante, imprévisible et nécessitant un 1er contact (sensibilisation) Hypersensibilité : réponse immunitaire inappropriée et exagérée vis-à-vis d’antigènes

Atteintes cellulaires : système immunitaire (immunotoxicité) (3) 4 types de réaction d’hypersensibilité Type Hypersensibilité Mécanismes Exemples I Immédiate Activation mastocytes, basophiles par IgE spécifiques Pénicilline -> choc anaphylactique II Par cytotoxicité (altération cellulaire) Activation complément par IgG, IgM Pénicilline -> hémolyse III Par complexes immuns (Ag/Ac) Dépôt complexes immuns Poussière animale -> alvéolite allergique IV Retardée Activation LT Latex -> eczéma de contact

Atteintes tissulaires : apoptose et nécrose Apoptose et nécrose : 2 mécanismes de mort cellulaire fondamentalement différents Différences mécanistiques Apoptose Processus actif de mort cellulaire programmée Initiée par des signaux internes (atteinte cellulaire) ou externes (signaux de mort cellulaire) Contrôlée par des gènes pro-apoptotiques et anti-apoptotiques Nécrose : processus passif

Atteintes tissulaires : apoptose et nécrose (2) Différences fonctionnelles L’apoptose est impliquée dans : Le remodelage tissulaire (signaux externes) La réparation tissulaire (élimination des cellules endommagées) Nécrose : survient lorsqu’une dose de toxique déborde les systèmes de défense Réparation des molécules altérées Élimination des cellules altérées par apoptose

Atteintes tissulaires : apoptose et nécrose (3) Différences morphologiques Mécanisme de l’apoptose : Condensation des constituants nucléaires et cytoplasmiques Formation de corps apoptotiques (vésicules) Phagocytose => Pas d’inflammation Mécanisme de la nécrose : Gonflement des cellules et des organites Rupture des membranes Libération de débris dans le milieu extracellulaire => Inflammation

Apoptose et nécrose

Atteintes tissulaires Nécrose Fibrose : dépôt en excès de matrice extracellulaire de composition anormale Ex : fibrose hépatique (éthanol chronique, CCl4) Cancérogenèse : transformation néoplasique des cellules

Synthèse des atteintes

Investigations toxicologiques

Risque toxique Le risque toxique est l’association d’un danger et d’une exposition à ce danger. Danger : toxicité inhérente à la substance, propriétés physico-chimiques… Exposition : quantités, fréquence et durée d’exposition, moyens de maîtrise… Exemple : éthylène glycol 2 ml/kg (aigüe, voie orale) entraîne un coma Peu volatil, souvent pénétration percutanée => Risque faible

Objectifs des investigations But : construire un profil toxicologique Évaluation du danger : identifier la toxicité de la substance Études in vivo chez l’animal Identifier une dose en dessous de laquelle il n’y a pas d’effets toxiques Évaluation du risque : évaluer en fonction de l’usage prévu, la probabilité que l’effet toxique survienne chez l’Homme Mesures de prévention, doses max, contre-indications, traitements…

Relation dose – toxicité "Toute substance est un poison … la dose adéquate fait la différence entre un poison et un remède." Paracelse, 1493-1541

Relation dose – toxicité (2) Ex : doses létales chez la souris, voie orale Eau : 10 000 mg/kg NaCl : 4 000 mg/gk Métaldéhyde : 200 mg/kg Strychnine : 1 mg/kg Toxine botulique : 10-6 mg/kg

Modalités d’exposition : dose Dose = concentration du toxique Hypothèse : la gravité de l’effet augmente avec la dose absorbée Objectif : « tracer » la relation entre la dose et l’effet 3 doses à tester au minimum + lot témoin (excipient, solvant…)

Voie d’exposition Action locale : effet direct sur le tissu exposé (peau, oeil …) ex : caustiques (acides, bases fortes …) Action à distance ou systémique (le + svt) : doivent être absorbés et distribués jusqu’à leur tissu cible (via circulation générale) pour exercer leur effet toxique Conditionne la rapidité et l’importance de la toxicité IV > voie respi. > IM > voie orale > voie cutanée

Périodicité d’exposition Les effets toxiques sont souvent différents en fonction de la fréquence et du temps d’exposition Intoxication aigüe : exposition sur un cours laps de temps, <24h (une seule fois, une seule dose) Intoxication subaigüe : exposition répétée, <1 mois (2 ou 4 semaines) Intoxication chronique : exposition répétée sur une longue période de temps, >1 mois à toute la vie (cancérogénèse)

Effet et exposition

Principales observations Nature ou type de dommage = effets toxiques Mort, symptomatologie, troubles fonctionnels Localisation Biologie, histologie Délai de réponse Effet immédiat : rapidement après l’exposition Ex : inhalation d’HCN (270 ppm) -> mort en qq minutes Effet retardé : après un certain laps de temps Ex : effets cancérogènes souvent après 20 ou 30 ans Réversibilité

Les études non cliniques Études de toxicologie générale Par administration unique Par administrations réitérées Études spécifiques Études sur la fonction reproductrice Études de cancérogenèse Études de mutagenèse Études de tolérance locale

Études de toxicité aiguë Principe : étude qualitative et quantitative des phénomènes toxiques qui se manifestent pdt une période donnée résultant d’une administration unique d’un xénobiotique Protocole Chez l’animal (mammifères : rongeurs) Doses : nombre suffisant >3 (généralement 5) Voie d’administration selon usage prévu Durée : 1 administration et observation pdt 14 jours

Études de toxicité aiguë (2) Observation périodique de l’animal Consommation alimentaire, prise de poids Comportement, activité Signes cliniques, conditions de la mort (date…) Autopsie : examen macroscopique des organes Résultats Statistiques : effets pour chaque sexe, dose, voie… Détermination de la dose létale 50 (DL 50) : valeur toxicologique de référence Rq : pour les gaz -> CL 50

Études de toxicité aiguë (3) DL 50 : dose de toxique qui tue 50% des animaux testés Grande variabilité : Voie d’exposition Espèces, souches, âge, sexe…

Études de toxicité aiguë (4) Produit Espèce animale DL50 (g/kg) voie orale DL50 (g/kg) voie cutanée Acétone Lapin Rat Souris 5,34 5,80 3,00 20,00 Méthanol 14,41 6,20 7,30 15,80 3 classes en fonction de la DL50 per os Très toxique (T+) : <25 mg/kg Toxique (T) : 25 à 200 mg/kg Nocif (Xn) : 200 à 2000 mg/kg

Les études non cliniques Études de toxicologie générale Par administration unique Par administrations réitérées Études spécifiques Études sur la fonction reproductrice Études de cancérogenèse Études de mutagenèse Études de tolérance locale

Études par administration réitérée Toxicité sub-aiguë (<1 mois) ou chronique (>3 mois) Objectif : Évaluation multi-expérimentale des altérations fonctionnelles et/ou anatomo-pathologiques consécutives à l’administration réitérée du xénobiotique -> organes cibles Déterminer la limite d’innocuité expérimentale NOAEL : No Observed Adverse Effect Level LOAEL : Lowest Observed Adverse Effect Level NOEL : No Observed Effect Level

Études par administration réitérée (2)

Études par administration réitérée (3) ED : dose efficace (chez 50 ou 99% des animaux) TD : dose qui produit l’effet toxique recherché LD : dose létale

Études par administration réitérée (4) Études : examen à t0 puis périodique Surveillance de l’animal : consommation alimentaire, hydrique, comportement Examens cliniques : poids, température, symptômes Examens biologiques : bilans sanguin, biochimique, urinaire Examens para-cliniques : éventuellement ECG, ophtalmo… Fin : euthanasie sauf si réversibilité (euthanasie plus tardive) Autopsie des organes et tissus : poids, examen macroscopique Examen anatomo-pathologique : lésions, modifications structurelles Étude statistique Effets induits par le toxique par rapport à un lot témoin NOAEL, LOAEL…

Études par administration réitérée (4) Point particulier de l’immunotoxicité Immunotoxicité directe (immunodépression, immunostimulation) Réponse anormale du système immunitaire : auto-immunité, hypersensibilité Surveillance : Formule sanguine Organes et tissus du système immunitaire : thymus, ganglion… Immunoglobulines…

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Études des fonctions reproductives Pendant longtemps, placenta = barrière infranchissable Affaire du thalidomide (sédatif) : apparition de malformations exceptionnelles (1957 - 1962) Phocomélie (raccourcissement des membres) Amélie (absence de membres) Troubles du SNC, auditifs, visuels, anomalies rénale et intestinales

Études des fonctions reproductives (2) Cas du diéthylstilbestrol (DES) : hormone pour prévenir les fausses couches, les risques de prématurité et traiter les hémorragies pdt la grossesse 160 000 enfants nés en France sous Distilbène® Malformations gynécologiques et + de 400 cas de cancers (vagin et col de l’utérus) chez les filles des mères traitées Stérilité, fausses couches, grande prématurité chez les mères Anomalies génito-urinaires chez les garçons

Études des fonctions reproductives (3) Objectifs : État des gamètes Aptitude à l’accouplement Fécondation Nidation, implantation Embryogenèse Croissance in utero Parturition Lactation, sevrage Effets tardifs sur la progéniture

Études des fonctions reproductives (4) Tests chez l’animal : manipulations aisées, nombreuses portées, temps de gestation courts Rongeurs : rat -> gestation 21-22 jours, 14 NNés / portée Non rongeurs : lapin -> gestation 28-34 jours, 8 NNés / portée Attention à l’extrapolation avec l’Homme ! Doses : 1 lot témoin + 3 doses Dose la plus forte Toxicité pour la mère -> perte de poids de 10% Pas embryo-létale (effet tératogène masqué) Pas trop faible (au-dessus du seuil efficace) Dose la plus faible = pas d’effet

Études des fonctions reproductives (5) Voie : voie d’usage (per os le plus souvent) Protocole : variant mais souvent on réalise un découpage en 3 segments

S1: étude de fertilité et développement embryonnaire précoce Espèce : rat avec 24 femelles et 24 mâles / lot Traitement avec toxique avant reproduction chez les 2 sexes Pdt l’étude : suivi des poids, comportement, consommation, symptomatologie chez les 2 sexes

S1: étude de fertilité et développement embryonnaire précoce (2) Observations à la fin de l’étude : Césarienne à la fin de la gestation (21 j) chez ½ des femelles gravides Index de fertilité = nbre de femelles gestantes / non gestantes Nbre de corps jaunes, nbre de fœtus vivants ou morts-nés (sexe, poids, examen morphologique…) Chez la ½ des femelles qui mettent bas normalement : nbre de NNés, sexe, mortalité Suivi de F1 jusqu’à F2 : poids, développement moteur et comportemental Sacrifice des mères et pères : examens des organes génitaux

S2: étude du développement embryo-fœtal Embryo- et fœto-toxicité = évaluation du pouvoir tératogène du toxique Espèces utilisées : Rat : 20 femelles / lot Lapin albinos : 12 femelles / lot Traitement pdt la période d’organogenèse

S2: étude du développement embryo-fœtal (2) Pdt l’étude : suivi classique des mères Fin de l’étude : Césarienne 24h avant de mettre bas (cannibalisme) à J20 chez la ratte et J28 chez la lapine Nbre de fœtus morts, vivants Poids, taille, sexe, aspect… Observations des anomalies morphologiques (viscères, squelette) et histologiques

Malformations sur un fœtus de souris

Organogenèse et sensibilité

S3: étude du développement péri- et postnatal Espèce : rat avec 12 femelles / lot Pdt l’étude : Examen classique des femelles Examen de la mise bas, des NNés, de l’allaitement Fin de l’étude : F1 et F2 ½ portée sacrifiée : examens classiques ½ portée pour les effets retardés : suivi de la génération F1 Viabilité, évolution pondérale Développement physique, fonctionnel, comportemental Évaluation des capacités de reproduction -> génération F2

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Études de cancérogenèse Cancérogenèse : processus qui aboutit à la formation d’un cancer Agent cancérogène : agent chimique provoquant l’apparition d’un cancer dît induit (≠ spontané) Objectifs : dépister les agents capables D’induire des tumeurs non spontanées par rapport à un groupe témoin D’augmenter l’incidence de tumeurs spontanées De raccourcir le temps de latence de tumeurs spontanées

Études de cancérogenèse (2) Protocole : études long terme in vivo Animal : principalement des rongeurs (rats, souris) dont les tumeurs spontanées qu’ils développent sont connues Nécessité de gros effectifs à cause de la grande variabilité inter-individuelle 50 / sexe / dose pour le lot exposé 100 / sexe pour le lot témoin Doses : 3 + lot témoin (dose supérieure = dose max tolérée, càd non létale et sans autres symptômes)

Études de cancérogenèse (3) Voie de pénétration selon usage prévu (souvent per os) Durée : toute la vie (rat : 24 mois, souris : 18 mois) Fréquence d’exposition : 7j / 7 Pendant l’étude : Consommation alimentaire, hydrique Comportement, poids Observation clinique par palpation : date d’apparition de la tumeur Fin de l’étude : autopsie avec examen macroscopique et anatomopathologique

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Études de mutagenèse Mutagenèse : processus qui aboutit à la création d’une mutation Agent mutagène ou génotoxique : agent chimique entraînant l’apparition d’une mutation dîte induite (≠ spontanée)

Études de mutagenèse (2) Objectif 1 : mise en évidence des toxiques induisant des mutations au niveau : Génique : modifications d’une ou plusieurs bases (substitution, délétion, insertion de bases) Chromosomiques Altération de la structure des chromosomes (cassures, réarrangements, anneaux) par des agents clastogènes Variation du nombre de chromosomes par les agents aneugènes Objectif 2 : prédictivité de la cancérogenèse (1ère étape) mais aussi d’un effet sur les fonctions reproductives

Études de mutagenèse (3) Protocoles : tests in vitro et in vivo rapides, sensibles et peu onéreux Pour chaque toxique, on effectue une batterie minimale de 3 tests : Test de mutation génique sur cellules procaryotes : test d’Ames (Mutatest) Test de mutation génique et chromosomique sur cellules eucaryotes : Mouse Lymphoma Assay Test in vivo de mutations chromosomiques : test du micro-noyau in vivo (+++)

Test de mutation génique sur cellules procaryotes Test d’Ames = test de mutation reverse sur Salmonella typhimurium portant des mutations dans les gènes nécessaire à la synthèse de l'histidine Souches auxotrophes pour l'histidine requièrent un apport d'histidine pour se développer Principe : évaluer la facilité que possède une substance à induire une réversion de la souche auxotrophe. Dans le cas d'une substance mutagène, on observe ainsi l'apparition de souches prototrophes, ne nécessitant qu’un milieu minimum d'histidine pour croître

Test d’Ames ou Mutatest

Test de mutation génq et chromq sur cellules eucaryotes Mouse Lymphoma Assay Cellules eucaryotes : lymphome murin L5178 Y TK+/- Locus thymidine kinase (TK+/-) : 1 seule copie fonctionnelle du gène (au lieu de 2 habituellement) Thymidine ou analogue toxique (trifluorothymidine, TFT) TK+/- TFT-monophosphate Intégration dans l’ADN Mort cellulaire Agent génotoxique Cellules TK+/- Cellules TK-/- Développement normal

Mouse Lymphoma Assay

Test in vivo de mutations chromosomiques Érythroblaste : cellule avec noyau de la mœlle osseuse dont la maturation aboutira à la formation du globule rouge Érythrocyte : cellule sans noyau (incapable de se diviser) = hématie ou globule rouge Principe du test du micro-noyau in vivo : Développement normal : division cellulaire des érythroblastes puis expulsion du noyau vers la circulation sanguine

Test in vivo de mutations chromosomiques (2) En présence de produit toxique, des morceaux de chromosome cassé se trouvent dans le cytoplasme. Lors de l’expulsion du noyau des 2 cellules filles, le petit bout d’ADN reste dans le cytoplasme -> Micro-noyau Protocole : Lots de 5 souris mâles et 5 femelles 3 doses + lot témoin et euthanasie à 24 ou 48h Observations sur moelle osseuse : frottis, coloration, microscopie optique pour dénombrement (% des cellules micro-nucléées par rapport au lot témoin)

Test du micro-noyau in vivo

Dénombrement par microscopie

Classification particulière européenne Classification CMR : cancérogène, mutagène et toxique pour la reproduction 3 catégories de substances CMR 1 : substances que l’on sait être CMR pour l’Homme, preuves suffisantes 2 : substances devant être assimilées à des substances CMR pour l’Homme, fortes présomptions (études chez l’animal) 3 : substances préoccupantes pour l’Homme, études insuffisantes

Étiquetage

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Études de tolérance oculaire Test d’irritation oculaire de Draize 9/6/92 (toxicité aiguë) Cible : partie antérieure de l’œil (cornée, iris, conjonctive) Protocole : 3 lapins albinos Produit : 0,1 ml (liquides) ou 100 mg (poudres) dans le sac conjonctival Contact pendant 1h Examens oculaires à 1h, 1, 2, 3, 4, 7 jours + à 21 jours pour la réversibilité

Études de tolérance oculaire (2) Notation : Conjonctive (/20) : recherche de chémosis (infiltration œdémateuse), larmoiement, rougeurs Iris (/10) : modifications de couleur, dimensions Cornée (/80) : recherche d’opacités (intensité et surface) Résultats : Indice d’irritation oculaire maximum (IOmax, 110) : permet la classification des produits de faiblement irritant à très irritant Indice d’irritation oculaire moyen (J1-2-3) : permet la classification des produits chimiques (CEE) > Non irritant > Irritant (R36) > Irritant sérieux (R41)

Études de tolérance oculaire (3) Méthodes alternatives : Test du Het Cam Hen’s Egg Test Chorio Allantoic Membrane = membrane chorio-allantoïdienne de l’œuf de poule de 10 jours Protocole : 300 μl de produit à tester (pur ou dilué) sur 3 œufs Rinçage au bout de 20 sec Observations dans les 5 minutes : Hyperhémie Hémorragie Coagulation

Études de tolérance oculaire (4) Notation en fonction du temps d’apparition Score Délai d’apparition (minutes) <0,5 0,5 – 2 2 – 5 Hyperhémie 5 3 1 Hémorragie 7 Coagulation ou thrombose 9 Classification : score sur la moyenne des 3 œufs 0 – 0,9 Pratiquement non irritant 1 – 4,9 Légèrement irritant 5 – 8,9 Modérément irritant >9 Irritant

Études de tolérance cutanée Test d’irritation cutanée de Draize (toxicité aiguë) Protocole : 6 lapins albinos : 2 zones rasées sur le dos Produit : 0,5 ml (liquide) ou 500 mg (poudres) Contact 24h sous compresse de protection Examens à 30 min et à 48h Notation : Présence d’érythème et d’escarre (/4) Présence d’œdème (/4)

Études de tolérance cutanée (2) Classification : Indice d’irritation primaire cutané (IPmax) : permet la classification des produits de non irritant à très irritant Indice d’irritation primaire cutané (J1-2) : permet la classification des produits chimiques (CEE) Irritant (R38) Effet corrosif (R34) Effet corrosif sévère (R35)

Études de tolérance cutanée (3) Méthode alternative : évaluation de la corrosion par modèle de peau humaine reconstituée -> matrice de collagène ou support polycarbonate -> Episkin®, Epiderm®

Études de tolérance cutanée (4) Test de sensibilisation allergique = étude de la capacité d’un produit à provoquer une allergie de contact 2 phases : Phase de sensibilisation Silencieuse Dose-dépendante Notion d’haptène (antigène avec PM < 1000 Da)

Phase de sensibilisation

Études de tolérance cutanée (4) Phase de révélation = phase symptomatique Nouveau contact Non dose-dépendante Examens cliniques Érythèmes Œdèmes Prurit, vésicules…

Phase de révélation

Cardiotoxicité

Pneumotoxicité

Neurotoxicité