LE MILIEU DE HUGH ET LEIFSON

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1 LE MILIEU DE HUGH ET LEIFSON
Source de C et N Composition Source de C, N, minéraux et vitamines Peptone pancréatique de caséine 2 g Extrait de levure 1 g Chlorure de sodium 5 g Phosphate monopotassique 0,3 g Glucose g Bleu de Bromothymol 0,03 g Agar (gélose) 3 g ED qsp 1 L Équilibre ionique Source de P Source de C à rajouter Indicateur de pH Vert pH basique ou neutre, jaune pH acide solidification du milieu gélose semi solide pH = 7,2 Milieu aqueux

2 Technique d’ ensemencement
1- Régénérer le tube 20 minutes au bain marie bouillant 2- Ajouter le volume de solution de glucose stérile dans le milieu en surfusion: à 45°C 3- A jouter trois gouttes de suspension bactérienne et refroidir immédiatement le tube sous l’eau froide. 4- Ne pas visser le tube à fond 5- Incuber 24 heures à 37°C lecture Virage de l’indicateur de pH au jaune dans tout le tube. Le milieu est devenu acide. Il y a eu production d’acides lors de l’utilisation du glucose par les bactéries en présence et en absence d’O2. Les bactéries sont fermentatives vis-à-vis du glucose. Virage de l’indicateur de pH au jaune dans la partie supérieure du tube. Le milieu est devenu acide. Il y a utilisation du glucose par les bactéries en présence d’ O2. Les bactéries sont oxydatives vis-à-vis du glucose. Le milieu reste tel qu’il était avant ensemencement. Il n’y a pas de culture. Les bactéries sont inertes vis-à-vis du glucose

3 Le milieu Citrate de Simmons
Composition Sulfate de magnésium 0,2 g Phosphate monopotassique 1 g Phosphate bipotassique 1 g Citrate de sodium 2 g NaCl g Bleu de Bromothymol 0,08 g Agar (gélose) 15 g ED qsp 1 L Sources minérales Seule source de C Equilibre osmotique Indicateur de pH Vert pH basique ou neutre, jaune pH acide pH = 6,8 6 7,6 Ensemencement Faire une strie centrale avec une suspension en eau physiologique ou directement à partir d’une colonie Ne pas visser le bouchon à fond Incuber 24 h à 37°C

4 Milieu de Clark et Lubs pH = 7 Composition
Peptone trypsique ou polypeptone 5 à 7 g Glucose 5 g Phosphate bipotassique 5 g ED qsp 1 L Sources minérales Source de C Source minérale pH = 7 Ensemencement Ensemencer avec 5 à 10 gouttes de suspension bactérienne. Ne pas visser le bouchon à fond Incuber 24 h à 37°C Test RM Après incubation, prélever 2 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse. Ajouter 1 à 2 gouttes de rouge de méthyle. Observer. 4,5 6,8 Test VP Après incubation, prélever 1 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse. Ajouter 0,5 mL d’-naphtol et 0,5 mL de soude. Mélanger et incliner le tube. Faire la lecture après 10 à 15 min de contact.

5 Milieu de Kligler Hajna
Composition Extrait de viande de boeuf 3 g Extrait de levure 3 g Peptone g Chlorure de sodium 5 g Citrate ferrique 0,3 g Thiosulfate de sodium 0,3 g Lactose g Glucose g Rouge de phénol 0,05 g Agar (gélose) 12 g ED qsp 1 L Source de C et N Equilibre osmotique Mise en évidence de la formation H1 S Source de soufre, témoin d’oxydo-rédcution Source glucidique majoritaire Source glucidique minoritaire pH = 7,4 Indicateur de pH 6,5 8,2 Ensemencement 1) Stries serrées sur la pente Öse ou pipette boutonnée 2) Piqûre centrale dans le culot Fil droit ou pipette boutonnée

6 Milieu mannitol mobilité nitraté
Composition peptone g Nitrate de potassium 2 g Mannitol g Rouge de phénol à 1 % 4 mL gélose 4 g ED qsp 1 L Sources de C et N Apport de nitrates Source de C Indicateur de pH pH = 8 Ensemencement Piqûre centrale avec le fil droit

7 Lecture des milieux Citrate de Simmons
1ère lecture possible 2nde lecture possible Le milieu présente une culture, l’indicateur de pH a viré au bleu  le milieu est devenu basique. Les bactéries ont utilisé le citrate comme source de carbone en produisant des composés alcalinisant le milieu: CITRATE + Le milieu ne présente aucune culture. Les bactéries n’utilisent pas le citrate comme source de carbone : CITRATE -

8 Clarck et Lubs 1- Test RM 2- Test VP 1ère lecture possible 2nde lecture possible 1ère lecture possible 2nde lecture possible Le milieu est devenu rouge  le pH est acide . Il y a eu formation de composés acides par les bactéries au cours de la fermentation du glucose. Les bactéries utilisent la voie des acides mixtes : RM +. Le milieu est devenu jaune  le pH est basique . Les bactéries n’utilisent pas la voie des acides mixtes lors de la fermentation du glucose : RM -. Formation d’une coloration rouge en surface . Il y a formation d’acétoïne et de butanediol dans le milieu lors de la fermentation du glucose. Les bactéries utilisent la voie du butanediol : VP +. Pas de modification du milieu . Les bactéries n’utilisent pas la voie du butanediol lors de la fermentation du glucose : VP -.

9 Mannitol mobilité 1- Utilisation du mannitol 2- Mobilité 1ère lecture possible 2nde lecture possible 1ère lecture possible 2nde lecture possible Le milieu est resté rouge  le pH est neutre ou basique . Les bactéries ne fermentent pas le mannitol : MANNITOL -. Le milieu est devenu jaune  le pH est acide . Les bactéries fermentent le mannitol et produisent des acides qui acidifient le milieu : MANNITOL +. Observation d’une culture dans tout le tube. Les bactéries ont diffusé dans tout le milieu : elles sont MOBILES. Culture uniquement au niveau de la piqûre centrale. Les bactéries sont IMMOBILES.

10 Kligler Hajna Précipité noir de sulfure ferrique Pas de précipité noir
1- lecture de la production d’H2 S 2- lecture de la production de gaz Précipité noir de sulfure ferrique Pas de précipité noir Production d’H2S par les bactéries ! H2S+ bactéries ! H2S- Présence de bulles dans la gélose Pas de bulle dans la gélose Les bactéries produisent du gaz (H2 ou CO2) au cours de leur fermentation : GAZ + bactéries ! GAZ -

11 Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE +
3- Lecture de l’utilisation du lactose Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE - Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE + Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE + Acidification du milieu en aérobiose lors de l’utilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif Le milieu reste orangé. Les bactéries n’utilisent pas le glucose et le lactose. GLC - et LAC - Pente jaune Culot rouge

12 Recherche de la -galactosidase
2) Ajouter stérilement un disque ONPG 1) Faire une suspension épaisse à partir de colonies prélevées sur la pente Elle s’effectue sur un tube de Kligler LAC - 3) Incuber à 37°C pendant 30 minutes 1) Le tube reste incolore.  absence de la -galactosidase : ONPG - 2) La suspension est colorée en jaune  présence de la -galactosidase : ONPG +, mais absence de la perméase.

13 Kligler Hajna Présence de bulles dans la gélose
1- lecture de la production d’H2 S 2- lecture de la production de gaz Pas de précipité noir Présence de bulles dans la gélose Pas de bulle dans la gélose bactéries ! H2S- Les bactéries produisent du gaz (H2 ou CO2 a)u cours de leur fermentation : GAZ + bactéries ! GAZ - Précipité noir de sulfure ferrique Production d’H2S par les bactéries ! H2S+ 3- Lecture de l’utilisation du lactose Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE - Tube jaune Pente jaune Tube orange Pente rouge Culot rouge Culot jaune Acidification du milieu en aérobiose lors de l’utilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE + GLC - et LAC - Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE +