La ségrégation des allèles

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1 La ségrégation des allèles
Pierre Ray Département de Génétique

2 Plan Rappels : le cycle cellulaire, la méiose, le chromosome
Dominance et récessivité Ségrégation allelique Liaison génétique

3 Rappel : le cycle cellulaire (1)
G1 G0 Mort cellulaire Préparation à la mitose Cellule quiescente Phase de synthèse de l’ADN Phases G1-G2 = INTERPHASE activité fonctionnelle de la cellule.

4 Rappel : l’ADN pendant le cycle cellulaire
Décondensation Chromatine à l’interphase 1 fibre d’ADN Fin de Phase S 2 fibres d’ADN 1 Chromosome Métaphasique Chromosome anaphasique Quantité d’ADN 4c 2c INTERPHASE G1 G0 S G2 MITOSE c MEIOSE 1ere Div 2ème Div

5 Rappel la méiose : 1ere division cellulaire
Phase G1 Chromatine à l’interphase 2c ADN, 2n chromosomes 1’ 1’’ 2’ 2’’ 2 Fin de phase S 4c ADN, 2n chromosomes à 2 chromatides 1’ 1’’ 2’ 2’’ 4 Prophase : Recombinaison des chromosomes homologues 4c, 2n à 2 chromatides 3 Prophase : condensation des Filaments en chromatides 4c, 2n à 2 chromatides Métaphase : Formation du fuseau bipolaire 4c, 2n à 2 chromatides 5 6 Anaphase

6 Rappel la méiose : 2eme division cellulaire
10 4 gamètes 1c ADN n chromosomes À 1 chromatide 9 Anaphase II Séparation des chromatines homologues 7 2 cellules filles à 2c ADN n chromosomes à 2 chromatides 8 Métaphase II

7 Caryotype “brut” normal 46, X,Y
G-Banding (Giemsa) sur noyau en prophase/métaphase Après traitement par la Cochicine : interagie avec les microtubules du fuseau = bloque la division cellulaire.

8 Méiose : conclusion génome diploïde gamètes haploïdes 46,XX 46,XY 23,X
Succession de 2 divisions cellulaires formant à partir d’une cellule diploïde (2n chromosomes) quatre cellules haploïdes (n chromosomes). génome diploïde gamètes haploïdes 46,XX 46,XY 23,X 23,Y Des recombinaisons ont lieu entre les chromatides non-sœur des chromosomes homologues lors de la 1ere division de Méïose. Du fait de ces recombinaisons tous les gamètes sont différents

9 Caryotype “final” normal 46, X,Y
Les chromosomes sont identifiés et appariés grace à la carte cytogénétique. Centromère Télomère Chromatides soeurs

10 Locus et allèles Mat. Allele Pat. Allele
Locus : site physique où se situe une séquence d’ADN (codante ou non) sur un chromosome Allèle : une des formes que peut prendre une même séquence, à un locus donné. Individu diploïde comporte pour chaque locus 2 allèles (1 mat, 1 pat) identiques :homozygote différents : hétérozygote Chromosomes Homologues Locus A Chromosome Maternel Chromosome Paternel Mat. Allele Pat. Allele Allèle sauvage : le plus fréquent/non pathologique.

11 Ségrégation allélique
séparation des allèles dans les cellules filles repose sur la disjonction des paires de chromosomes lors de la méïose probabilité de transmission d’un gène maternel ou paternel est de 1/2

12 Les lois de transmission des caractères chez le pois par Grégor Mendel
Les 3 premières lois de l'hérédité dans la 1ère génération d'un croisement impliquant 2 lignées pures différant par un unique caractère, tous les individus présentent un même phénotype. Le caractère qui se manifeste dans la génération F1 est qualifié de dominant et le caractère qui en est exclus est qualifié de récessif dans la descendance d'un croisement impliquant 2 individus F1 (génération F2), les 2 caractères parentaux réapparaissent suivant une proportion prédictible de 3:1 si l'on croise des lignées pures différant pour plusieurs caractères, chacun de ces caractères se comporte de façon indépendante vis-à-vis de l'autre

13 Dominance – Récessivité. Expression phénotypique des différents allèles
Génotype : constitution allélique des gènes d’un individu (à un locus donné). Phénotype : manifestation visible du génotype. Plus généralement c’est l’ensemble des caractères observables d’un individu, dépend du génotype en interaction avec le milieu. Dominance : l’allèle dominant A manifeste toujours son caractère Co-dominance : Aa exprime à la fois le génotype AA et aa (ex : Groupes sanguins A et B) Semi-dominance : phénotype Aa est intermédiaire entre AA et de aa Récessivité Allèle récessif a ne se manifeste pas en présence de A, ne s’exprime qu’à l’état homozygote

14 Ségrégation d’un couple d’allèles
Individu AA : gamètes A PA = 1 Individu aa : gamètes a Pa = 1 Individu Aa : gamètes A ou a PA = 1/2 Pa = 1/2 Tableaux des gamètes : AA x aa : [A] x [a] Phénotype : 100% [A] Aa x aa : [A] x [a] Phénotype : 50% [A] AA x Aa : [A] x [A] Phénotype : 100% [A] - Phénotype : 75% [A] Aa x Aa : [A] x [A] :

15 Ségrégation de deux couples d’allèles : Aa , bB (1)

16 Ségrégation de deux couples d’allèles : Aa , bB (2)
Fin 1ere division b a A B a B A b Gamètes 25% a, b 25% A, B 25% a,B 25% A, b

17 Ségrégation de deux couples d’allèles
Individu AABB : gamètes AB p(AB) = 1 Individu aabb : gamètes ab p(ab) = 1 Tableaux des gamètes : AABB x aabb : Phénotype : 100% [AB]

18 Ségrégation de deux couples d’allèles
Individu AaBb, phénotype [AB] 4 types de gamètes : AB ou Ab ou aB ou ab. pAB = pab = pAb = paB = 1/4 Tableaux des gamètes : AaBb x AaBb 9 Génotypes : AABB, AABb, AaBb, Aabb, AaBB, aaBB, aaBb, AaBb, aabb 4 Phénotypes : 2 parentaux : p[AB] = 9/16, p[ab] = 1/16 2 recombinés : p[Ab] = 3/16, p[aB] = 3/16

19 Loi de ségrégation indépendante des caractères
pendant la méïose, la ségrégation d’une paire d’allèles est indépendante de la ségrégation d’une autre paire d’allèles Pour 1 couple d’allèles 2 types de gamètes 3 génotypes Pour 2 couples d’allèles 22 = 4 types de gamètes 32 = 9 génotypes Pour 3 couples d’allèles 23 = 8 types de gamètes 33 = 27 génotypes Pour n couples d’allèles 2n types de gamètes 3n génotypes loi vérifiée que dans le cas de couples d’allèles indépendants (situés sur des chromosomes différents)

20 Liaison génétique Coségrégation de 2 ou plusieurs allèles au cours de la méïose en raison de la proximité physique de leur locus sur le génome

21 Recombinaison (I) Echange réciproque de matériel génétique entre les chromatides de chromosomes homologues survenant lors de la méïose au niveau des chiasmas Mécanisme responsable des recombinaisons génétiques Pendant le pachytène crossing over entre les deux chromatides non sœurs des bivalents. Positions auxquelles un crossing over s’est produit : chiasma, début du diplotène

22 Recombinaison(II)

23 Exercice sur la cartographie de restriction
Recombinaison (III) Recombinaisons génétiques aléatoires et imprévisibles loi statistique : la probabilité de recombinaison entre 2 locus dépend de la distance physique qui les sépare. en moyenne 60 chiasmas par génome diploïde pendant la méïose points chauds de recombinaison variation du nombre de crossing over en fonction du sexe (femme > homme) Taux de recombinaison  entre deux locus pourcentage de gamètes recombinés parmi l’ensemble des gamètes transmis par les parents.  = nombre de gamètes recombinés / nombre de gamètes transmis indépendance des 2 locus :  = 1/2 liaison des 2 locus : 0   < 1/2 La fréquence de recombinaison en % est donc le total des recombinants sur le total de la descendance. Position relative et distance entre les gènes : le centimorgan Nous posons comme principe que la probabilité d’un enjambement entre 2 gènes est directement proportionnelle à la distance qui les sépare. On a défini par convention un centimorgan comme une unité cartographique ou grossièrement une distance sur un chromosome, équivalente à la fréquence de recombinaison de 1%. 1% de fréquence de recombinaison = 1 centimorgan Il est possible ainsi de construire une carte génétique à partir des données des enjambements. (Voir fig. 14.8) La carte génétique est l'ordonnancement de marqueurs grâce à l'analyse statistique de leur ségrégation au cours des générations. Ces marqueurs doivent donc être polymorphes (présenter différents allèles identifiables) et peuvent être localisés dans un exon (variations phénotypiquement détectables) ou (plus couramment) dans un intron (variations détectables au niveau de l'ADN). Les distances se mesurent en centimorgans (cM).   Pour en savoir plus sur le Centimorgan : Centimorgan (cM) (Utilisé pour la 1ère fois par Morgan et Sturtevant en 1913). Unité de mesure de la distance sur la carte génétique. Lors de la méiose, des marqueurs situés sur un même chromosome peuvent être séparés s'il se produit un crossing-over dans la région qui les sépare. La probabilité qu'un tel évènement se produise est proportionnelle à la distance qui sépare ces marqueurs. La fréquence de recombinaison reflète donc des distances entre marqueurs et l'unité de distance est le centiMorgan (cM) : 1 cM ést égal à 1% de crossing-over (1 crossing-over pour 100 méioses).     L'établissement d'une carte génétique permet : -D'établir des ponts d'ancrage pour la carte physique. -D'identifier la région et le gène responsables d'une maladie monogénique donnée (par clonage positionnel). La densité des marqueurs sur la carte peut également permettre de localiser les régions impliquées dans les maladies multifactorielles. -D'étudier certaines particularités de la méiose, telle que la variation de fréquence des recombinaisons : en fonction du sexe en fonction de la région du génome Ainsi, par exemple, on a constaté que la carte génétique humaine chez la femme est plus grande que chez l'homme (d'environ 40%) car les évènements de recombinaison en méioses femelles sont en moyenne plus fréquents qu'en méioses mâles, particulièrement dans les régions centromériques. Trois types de marqueurs sont préférentiellement utilisés : les RFLP, les microsatellites et plus récemment, les SNP.     Distance génétique et liaison entre marqueurs : Dans le cadre de la cartographie génétique, la distance entre deux marqueurs est calculée par une analyse statistique (analyse de liaison) et suppose donc la disponibilité d'ADN génomique issu de données familiales (de pedigree) ou des données de populations : Pour établir la carte génétique du génome humain, Jean Dausset (CEPH) a sélectionné un ensemble de familles humaines présentant un nombre élevé de générations et d'enfants dont les données génomiques sont mises à la disposition de la communauté scientifique. Pour les organismes modèles, l'établissement de la carte est grandement facilité par les possibilités d'élevage et de croisement qu'ils permettent.   Les étapes de la cartographie génétique  Etape 1 : Assignation des marqueurs sur le chromosome L'utilisation d'hybrides somatiques monochromosomiques : permet de déterminer de quel chromosome humain provient un marqueur donné. Ensuite, l’utilisation d’une méthode de type FlSH : permet de déterminer la position du marqueur sur le chromosome.   Etape 2 : Génotypage du marqueur Détermination des allèle pour chacun des marqueurs chez les différents individus.   Génotypage par RFLP  (Polymorphisme des fragments de restriction): L'analyse de RFLP s'effectue en utilisant comme sonde le fragment d'ADN RFLP sur un southern blot comprenant les ADN génomiques des différents individus digérés par un enzyme de restriction. Chaque fragment d'une taille donnée recensée constitue un allèle du marqueur étudié. Nécessite une quantité importante d'ADN génomique.   Génotypage par microsatellite : L'analyse s'effectue en utilisant les séquences flanquantes d'un microsatellite donné (communes aux différents individus à étudier) pour amplifier celui-ci chez les différents individus. La taille des différents produits amplifiés (correspondant aux différents allèles du microsatellite) est alors évaluée par électrophorèse.     Génotypage par SNP : Le génotypage des SNP se fait par spectrométrie de masse. Il repose sur la méthode de "primer extension" qui génère des produits ayant une masse spécifique pour chaque allèle. Les allèles se distinguent par leur différence de masse, facile à interpréter automatiquement par ordinateur. Cette approche permet le génotypage en série des SNP, chacun d'eux pouvant être caractérisé dans un grand nombre d'échantillons.  Les SNP sont des marqueurs particulièrement intéréssants pour la pharmacogénomique et la pharmacogénétique.  Le CNG (Centre National du Génotypage, à Evry) est un centre dans lequel on étudie la variabilité du génome en analysant les SNP ainsi que les mutations impliquant plusieurs bases. Les chercheurs du CNG partent des séquences de référence établies par le Génoscope et d'autres centres de séquençage et mettent en évidence les différences trouvées chez un grand nombre d'individus. Ils étudient ainsi la transmission d'une maladie au sein d'une même famille pour localiser les régions du génome qui contiennent les gènes impliqués. L'objectif à terme est d'être capable d'établir un diagnostic directement à partir du génome, d'adapter un traitement à chaque individu ou même de faire de la thérapie génique.     Etape 3 : Analyse de liaison Constitution des groupes de liaison (analyse de bipoint) Evaluation statistique du degré de liaison de tous les marqueurs pris deux à deux. Ordonnancement des groupes de liaison (analyse multipoint) Evaluation statistique de la vraisemblance de chacun des ordres possibles des groupes de liaison. Les RFLP sont en général seulement biallélique (absence/présence d'un site de restriction) : il est plus difficile de les ordonner entre eux avec précision que les microsatellites.   Pour en savoir plus sur l’analyse de liaison : GO TO Analyse_de_liaison.html  Un exemple de carte génétique pour le coton, carte réalisée par le CIRAD : La carte physique est l'ordonnancement de fragments clonés chevauchants reconstituant la molécule d'ADN de départ. C'est à partir de cette carte que sera choisi l'ensemble minimal de fragments assurant la couverture complète du génome à séquencer. Les distances, mesurées en paires de bases (pb), entre les différents marqueurs sont dites absolues. L'établissement d'une carte physique utilise les données des cartes de liaison et des informations de recouvrement partiel entre les fragments clonés permettant de définir des groupes de chevauchements.  L’objet de la cartographie physique est de localiser les gènes sur les chromosomes. Pour cela, des techniques d’hybridations in situ ou d’analyses de lignées cellulaires hybrides peuvent être utilisées. Ces méthodes permettent d’assigner à leur chromosome, des gènes placés sur la carte génétique. Nous ne détaillerons pas ici ces méthodes d’hybridation moléculaire. Beaucoup de gènes peuvent être localisés physiquement alors qu’ils ne le sont pas génétiquement. Ceci car les méthodes d’hybridation ne se limitent pas aux gènes polymorphes comme c’est le cas pour les méthodes de cartographie génétique par croisement. Notons que l’ordre est toujours le même sur une carte génétique et une carte physique. Seules les distances relatives changent. Les cartes de restriction par digestion enzymatique Résumé : Représentation graphique de la localisation des sites de restriction sur une molécule d'ADN, après avoir soumis celle-ci à une digestion enzymatique.   Une carte de restriction identifie dans l'ADN une suite linéaire de sites séparés par une distance réelle (en nombre de paires de bases). Ces sites correspondent à des coupures de la séquence par des enzymes de restriction. Une enzyme de restriction est un outil biologique qui coupe, de manière reproductible, la molécule d'ADN en des sites correspondant à l'occurrence d'un motif de 4, 5 ou 6 bases spécifique à l'enzyme. On dit aussi que l'enzyme digère une séquence. Les tailles des fragments qui résultent de ces coupures sont ensuite mesurées. La cartographie de restriction a pour objectif de reconstituer la séquence d'ADN en réordonnant les fragments issus des digestions. L'utilisation de modèles mathématiques pour constituer la carte de restriction s'appuie sur les résultats obtenus à partir de digestions partielles ou complètes de la séquence. En contrôlant les conditions expérimentales, on peut réaliser soit une digestion totale, soit une digestion partielle. En condition de digestion totale, tous les sites de coupure sont coupés, alors que dans une digestion partielle, une proportion des sites de coupures restent intacts. On réalise généralement une digestion complète par enzyme et une double digestion qui consiste à utiliser simultanément deux enzymes (cf. Figure ci-dessous).       Légende Fig16 Illustration d'une double digestion complète. 1) La séquence est digérée complètement par A en donnant 4 fragments, par B en donnant 3 fragments puis par A+B en donnant 6 fragments. Le nombre de permutations à analyser pour reconstruire la séquence à partir des deux digestions simples est (4!* 3!)/2 . Ainsi le nombre de cartes possibles pour cet exemple est Reconstitution de la séquence. Les fragments sont ordonnés de manière à satisfaire la reconstitution simultanément pour la séquence coupée avec A, celle coupée avec B et celle coupée avec A+B.     Le problème est alors de déduire la position des sites de coupure des enzymes de restriction à partir des longueurs des segments obtenus par l'action des enzymes A, B et A+B. Dans la pratique, il est nécessaire d'énumérer exhaustivement les solutions et il a été montré que, pour ce problème, le nombre de solutions croît en moyenne, et avec une probabilité de 1, de manière exponentielle en fonction de la longueur du segment d'ADN traité. Cependant, un nombre excessif de solutions est généralement sans intérêt et le problème doit être << contraint >> via l'utilisation d'autres sources d'informations (digestions partielles, autres enzymes...). De nombreux programmes ont été développés pour répondre à ce problème. Il semble qu'une résolution basée sur la propagation de contraintes reste l'approche la plus robuste pour traiter simultanément digestions partielles et doubles digestions complètes. GA1 est un résolveur de problèmes sous contraintes dédié à la cartographie de restriction. Le problème peut se modéliser de la façon suivante : variables : à chaque fragment et site de coupure est associée une variable représentant les positions possibles des fragments et sites de coupure ; valeurs : pour chaque variable, l'ensemble des valeurs est donné par l'ensemble des positions possibles pour les fragments (1 à n pour l'enzyme A, 1 à m pour l'enzyme B, 1 à t pour les enzymes A et B utilisées simultanément) ou les sites de coupure (position dans la séquence) ; contraintes : ce sont celles définies plus haut dans cette section, à savoir, pour toute affectation partielle de fragments et sites de coupure correspondant à une enzyme A, imposer la compatibilité avec les positions possibles des sites de coupure correspondant à la double digestion contenant cette enzyme. À chaque cycle, le résolveur de contraintes progresse en affectant une valeur soit à un site, soit à un fragment. Une affectation partielle inconsistante provoque un retour-arrière sur l'affectation précédente... Les principales qualités de GA1 relativement à d'autres approches sont sa robustesse quant au manque de fragments et son efficacité. Cette efficacité est associée à l'existence d'un nombre important d'heuristiques. De plus GA1 traite les digestions partielles et complètes contrairement à la plupart des programmes qui traitent uniquement des digestions complètes. Cependant, lorsque des erreurs se glissent dans les données (erreurs sur les longueurs de fragment par exemple) GA1 ne se comporte pas mieux (ni moins bien) que d'autres approches. En effet, pour des taux d'erreur réalistes sur les longueurs des fragments allant de 2,5% (minimum) à 10%, plusieurs milliers de cartes peuvent être générées. Ce nombre de solutions est bien trop élevé et revient à n'avoir aucune solution.   Pour en savoir plus sur la manière de construire une carte de restriction : GO TO Petit exercice d’application :     Exercice sur la cartographie de restriction    On fait agir sur un brin d'ADN linéaire deux enzymes de restriction afin de rechercher les sites de coupures de ces deux enzymes  et de construire les cartes de restiction corrrespondantes ainsi que la carte combinée. La digestion terminée, chaque lot d'ADN est soumis à une électrophorèse qui sépare les fragments d'ADN selon leur taille. Le document suivant donne les électrophorèses après des digestions simples et multiples.          1°) Quel est la longueur du brin d'ADN  utilisé ? 2°) Combien le frament d'ADN possède-t-il de sites de coupure pour l'enzyme 1 ? Pour l'enzyme 2? 3°) Utilisez le document suivant pour ordonner les différents fragments obtenus.    Lycée Robert Doisneau VAULX EN VELIN      Les cartes cytogénétiques   L'hybridation moléculaire in situ sur métaphases colorées (FISH) permet de localiser et d'ordonner directement des sondes correspondant à des gènes, des marqueurs génétiques, etc. Il est ainsi possible d'établir des cartes cytogénétiques dont la résolution maximale est la bande, soit environ 3 à 10 cM, ce qui implique, dans le meilleur des cas, une résolution d'environ une à trois Mb. En revanche, lorsque cette même technique est appliquée sur chromosomes interphasiques (Rappold et al 1984), la chromatine étant près de 20 fois moins condensée, la résolution peut atteindre 50 à 1000 kb (Trask et al 1989, Lawrence et al 1990). Une résolution de 10 à 200 kb peut être obtenue en hybridant les sondes directement sur la chromatine extraite des noyaux (l'ADN décondensé forme des boucles autour des restes de matrice cellulaire, donnant l'impression d'un halo). Enfin, une précision de l'ordre de la kb est à présent atteinte avec l'hybridation sur chromosomes étirés (Fiber FISH et peignage moléculaire). Les segments d'ADN, étirés au point d'atteindre un état double brin relâché, permettent l'hybridation et sont visibles sous microscope. L'utilisation de fluorochromes différents produit une image multicouleur à partir de laquelle il est possible d'orienter, d'ordonner des contigs de YAC, BAC ou cosmides, de mesurer la taille des recouvrements et des trous et donc d'établir une carte fine de la région concernée.       Pour en savoir plus sur les différentes méthodes de cartographie physique : GO TO

24 Recombinaison (IV) Ap Bm Am Bp 25% = 50% gamètes parentaux
= 50% gamètes recombinés méïose Allèles non liés 25% 25% Ap Am Bm Bp méïose > 50% gamètes parentaux < 50% gamètes recombinés Allèles liés

25 Thomas Hunt Morgan Morgan découvre un certain nombre de mutations. Il étudie leur transmission d’une génération à l’autre. Il découvre 4 groupes de liaison: les mutations ne se répartissent pas au hasard dans les descendants. Il émet l'hypothèse que ces quatre groupes de liaison sont assimilables aux 4 paires de chromosomes de la drosophile. La liaison étant donc "simplement le résultat mécanique de la localisation des gènes dans les chromosomes” Morgan présente avec Alfred Sturtevant en 1913 la première carte génétique. Depuis on a défini le centiMorgan (cM) comme unité de recombinaison: 1 cM étant égal à 1% de crossing-over.

26 Les expériences de Morgan, indépendance des caractères (1)
On croise deux lignées pures de drosophiles : Type sauvage : ailes longues [L] et yeux rouges [R] Double mutant : aux ailes vestigiales [v] et sans yeux [w] La descendance (F1) est constituée uniquement d’individus aux ailes longues et aux yeux rouges. L R w v Gamètes F1 1 2 Les males de (F1) X femelles (vv,ww) donnent 4 phénotypes dans les mêmes proportions L w v R F1= [ LR] 1 2 L R v w x Gamète sauvage Gamète muté 1 2

27 Les expériences de Morgan, indépendance des caractères (3)
Tableau des gamètes : Phènotypes attendus : 0.25: 0.25: 0.25: 0.25

28 Les expériences de Morgan, indépendance des caractères (2)
w v R 1 2 497 [LR] 502 [ Lw] 510 [vR] 498 [vw] On croise les males de (F1) avec femelles (vv,ww) x L R w v Gamètes F1 1 Gamète muté 2 Confirmation de la loi de ségrégation indépendante des caractères avec 0.25: 0.25: 0.25: 0.25

29 Les expériences de Morgan, association des caractères (1)
On croise : lignée sauvage (LL, RR), Double mutant : ailes vestigiales (vv) et aux yeux bruns (bb). La descendance (F1) est constituée uniquement d’individus [L,R] Les males de (F1) X femelles (vv,ww) donnent les 2 phénotypes sauvages dans les mêmes proportions. b v 2 L R Gamètes des F1 males L b v x Gamète sauvage Gamète muté F1= [ LR] 2 R

30 Les expériences de Morgan, association des caractères (2)
On croise alors des males (F1) avec des femelles (vv,bb). On obtient : 996 [L,R], 1008 [v,b]. b v 2 L R 50% [ LR] 50% [vb] b v x Gamètes muté 2 L R Gamètes des F1 males Pas de recombinaison au cours de cette méiose

31 Les expériences de Morgan, association des caractères (3)
On croise (LL, RR), et (vv,bb). F1 est constituée uniquement d’individus [L,R] On croise alors des femelles de (F1) avec des males (vv,bb). On obtient : 716 [LR], 702 [vb], 296 [Lb], 238 [vR]. b L 2 v R Gamètes des F1 femelles L b v x Gamète sauvage Gamète muté F1= [ LR] 2 R

32 Les expériences de Morgan, association des caractères (3)
[Lb] [vR] [ LR] [vw] b v 2 L R 716 702 296 238 b L 2 v R Gamètes des F1 males x Gamète muté On observe des recombinaison lors de la méiose femelle Nb total de méioses : 1952 Nombre de gamètes recombinés : 534 Fraction des gamètes recombinés : 534/1952= 0.27%. Distance entre les 2 loci = 27 cM

33 Morgan Conclusions Morgan a confirmé les lois de ségrégation des caractères de Mendel. Démontré l’indépendance de certain caractères et l’association d’autres et confirmé la notion de chromosomes. Défini la notion de recombinaison et conclu qu’elle était fonction de la distance entre les gènes positionnés sur un même chromosome et a pu établir une carte génétique de la drosophile. A observé que les recombinaisons chez la drosophile avaient lieu uniquement lors de la méiose des femelles. Ailes vestigiales Yeux bruns Sans Yeux w

34 Cartographie du génome : Cartes génétiques
Ordonnancement de marqueurs polymorphes grâce à l’analyse statistique de leur ségrégation (transmission) au cours des générations Observation empirique : analyses familiale et statistique possibilité de distinguer les 2 allèles disposer d’un nombre suffisant de méïoses pour permettre à l’analyse statistique d’être significative Cartes établies à partir de la fréquence des recombinaisons méïotiques Distance exprimée en centiMorgan 1 cM correspond à une fréquence de recombinaison de 1 % entre 2 marqueurs (1 crossing over pour 100 méïoses = 99% gamètes parentaux, 1% recombinés) Carte génétique de la femme est environ 40 % plus grande que celle de l’homme (nombre de recombinaisons supérieur)

35 Cartographie du génome : Cartes physique
Marqueurs polymorphes Distance physique (Millon pb) Gènes Carte cytogénétique Ordonnancement de fragments clonés chevauchants reconstituant la molécule d’ADN de départ Distances mesurées entre les différents marqueurs sont en paires de bases et sont dites absolues En moyenne 1 cM = 106 pb Même ordre des marqueurs pour la carte génétique et la carte physique, seules les distances relatives changent La distance génétique est une approximation de la distance réelle physique

36 Les différent type de polymorphismes
De nombreux marqueurs génétiques sont présents tout au long du génome. - Minisatellites : nombre variable de répétitions de séquences courtes ( nt) - Microsatellites : nombre variable de répétitions de nucléotides répétés (2, 3 ou 4) SNPs : Single nucléotide polymorphisms : substitutions d’un nucléotide.

37 Identification des allèles par PCR fluorescente
Les allèles des marqueurs microsatellites se distinguent après amplification du locus par PCR et migration éléctrophorètique (séparation des fragments amplifiés en fonction de leur taille). Primers Laser sensor Amplified product Fluorescence Size (bp) 100 20 Electropherogram

38 Amplification d’un marqueur microsatellite
CA, n=5 Allèle Paternel Allèle Maternel Individu homozygote pour le marqueur étudié. CA, n=8 CA, n=5 Allèle Paternel Allèle Maternel Individu hétérozygote pour le marqueur étudié.

39 Marqueurs, locus et haplotype
Un haplotype est la constition allèlique d’un individu pour plusieurs loci contigus, normalement hérités en block par l’un des parent. Chr 7 D7S655 Locus Gene Markers D7S3112 CFTR M Alleles Chr. Pat. 2 3 4 7 8 Alleles Chr. Mat. N 7q31.2 Localisation Chromosomique 7q32 7p22 7p11 Haplotype Morbide Haplotype normal

40 Exemple d’une étude familiale de ségrégation
D7S3112 4 2 D7S3112 5 3 D7S655 8 3 D7S655 7 2 D7S3112 5 2 ∆ ∆ D7S655 7 3 M M

41 Example d’une étude familiale de ségrégation (2)
3 D7S3112 D7S655 M Mat. 4 8 N 3 2 D7S3112 D7S655 5 7 M Pat. NN 4 8 3 2 MN 3 2 4 8 5 7 MM 2 3 5 7

42 Application : Etude familiale de ségrégation, identification du gène morbide
Exemple : L'hyperthermie maligne, 6 gènes identifiés, dont MHS5 et RYR 1. Etude de liaison au locus MHS5 I:1 2 1 3 D19S220 D19S421 RYR1 D19S422 I:2 II:1 II:2 Etude de liaison au locus RYR 1 RYR 1 est candidat I:1 3 2 1 D1S3766 D1S3767 MHS5 D1S3768 D1S3769 I:2 II:1 II:2 Exclusion du gène MHS5

43 Conclusion L’étude de la ségrégation des allèles par analyse de marqueur polymorphe est un outil puissant qui peut être utilisé en recherche, pour la cartographie du génome ou en diagnostic génétique. Les paradigmes établis au début du siècle (et avant) constituent toujours la base de la génétique moderne.