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Quantifier les Microorganismes. Méthodes Mesure de turbidité Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs.

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1 Quantifier les Microorganismes

2 Méthodes Mesure de turbidité Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs

3 Nombre le Plus probable: NPP –Fondé sur les statistiques de probabilités –Test présomptif fondé sur des caractéristiques données –Technique en bouillon

4 Nombre le Plus Probable (NPP) Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de léchantillon à être testé dans chacun de 3 tubes Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque dilution dans chaque tube Après une période dincubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

5 NPP- Suite Lobjectif est de DILUÉ lorganisme à zero Après lincubation, le nombre de tubes qui démontre les caractéristiques désirées sont enregistré –Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre Dilutions: Tubes positifs: P : Nombre de tubes positifs N : Quantité totale en (g) ou (ml) déchantillon dans tous les tubes négatifs T : Quantité totale en (g) ou (ml) déchantillon dans tous les tubes

6 NPP Calcul –Dilutions: –Tubes positifs: P = 9 N = (3 X (0,1 X ) + (3 X (0,1 X ) T= (3 X (0,1 X ) + (3 X (0,1 X ) + … (3 X (0,1 X ) = 9/0,001 = bactéries/g

7 Comptes Directes Léchantillon à être énuméré est appliqué sur une lame dhémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

8 Déterminer le Compte Direct 8 Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants –8, 8 et 5 Déterminer la moyenne –( )/3 =7 –Donc 7 cellules/carré

9 Déterminer le Compte Direct (suite) 9 Calculer le volume dun carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X cm 3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume dun carré –Donc 7/ 1 X ml = 7 X 10 4 cellules/ml 1mm Depth: 0.1mm

10 Problème Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame dhémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans léchantillon original si la cellule de comptage possède 100 carrés?

11 Microscopie Colorations Différentielles

12 Coloration de Gram Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives 12

13 Colorées Mauves –Bacille Genres: Bacillus et Clostridium –Coccus Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus 13

14 Colorées Rouges –Bacille: Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. –Coccus: Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter 14

15 Paroi Cellulaire 15 Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique Couche de Lipopolysaccharide Absente Gram + Vs Gram -

16 Méthode - Coloration Primaire 1.Coloration avec le cristal violet 2.Ajout diode de Gram (Mordant) + Gram positifGram Négatif Membrane plasmique Paroi :peptidoglycane LPS

17 Méthode - Étape Différentielle 3.Lavage à alcool Gram positifGram Négatif Membrane plasmique Paroi :peptidoglycane LPS Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé Paroi nest pas déshydratée – Complex nest pas piégé

18 Méthode - Contre Coloration 4.Coloration avec la Safranine Gram positifGram Négatif Membrane plasmique Paroi :peptidoglycane LPS

19 Sommaire 19 Fixation Coloration primaire Violet de cristal Contre coloration Safranine Lavage Décoloration

20 Coloration Acido-Alcoolo-Résistante Coloration diagnostique de Mycobactérium –Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre –Paroi cellulaire avec acide mycoïque 20

21 Méthode Principe: –Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants 21

22 Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur Coloration avec de la fuchsine basique –Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de lalcool acide –Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant 22

23 Coloration de Spores Spores: –Cellule bactérienne différentiée –Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques –Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium –Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à lendospore 23

24 Coloration au Vert de Malachite Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine 24 Cellules végétatives Spores Endospore Sporangium

25 Les Pathogènes

26 19 e Siècle- Robert Koch Étudie la maladie de lanthrax qui tue le bétail Fait croître la bactérie à partir du sang danimaux malades en culture pure –Bacillus anthracis Observations: –Le sang danimaux malades transmet la maladie –Le microorganisme se retrouve seulement chez les animaux malades –Le microorganisme crû en laboratoire transmet la maladie aux animaux sains 26

27 Robert Koch (suite) Conclusion: Les microorganismes sont responsables des maladies –Les pathogènes Ces résultats mènent Robert Koch à élaborer des lignes directrices pour lassociation dun microorganisme à une maladie –Les postulats de Koch 27

28 Postulats de Koch Le microorganisme doit être présent dans chaque cas de maladie, mais absent des organismes sains Le microorganisme suspect doit être isolé et cultivé en culture pure La maladie doit se développer quand le microorganisme isolé est inoculé dans un hôte sain Le même microorganisme doit être isolé à nouveau de lhôte malade 28


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