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-1- Roche Cancéro -1- Roche Cancéro Cancer du sein Statut HER2 et IHC Limportance de la phase technique.

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1 -1- Roche Cancéro -1- Roche Cancéro Cancer du sein Statut HER2 et IHC Limportance de la phase technique

2 -2- Roche Cancéro -2- Roche Cancéro Détermination du statut HER2 par IHC et FISH/CISH

3 -3- Roche Cancéro -3- Roche Cancéro Activation par amplification Oncogène HER2, chr 17q1-2 Surexpression de la protéine

4 -4- Roche Cancéro -4- Roche Cancéro Tumeurs HER2 (+++) Lobulaires< 5% Canalaires< 2 cm10 à 15% > 2 cm20 à 25% grade I0% grade II11% grade III27% Cancers inflammatoires30% Cancers de la femme jeune

5 -5- Roche Cancéro -5- Roche Cancéro Hybridation in situ en fluorescence (FISH) et Chromogenic in situ hybridization (CISH) : amplification du Détermination du statut de HER2/neu Immunohistochimie (IHC) : expression de la gène protéine

6 -6- Roche Cancéro -6- Roche Cancéro Les cellules tumorales des cancers du sein Nombre de chromosomes anormaux +++ ( aneuploïdie) HER-2: 17q21.1 Dr AURIAS, Institut Curie, Paris

7 -7- Roche Cancéro -7- Roche Cancéro Sur-représentation dHER-2 des polysomies 17 des translocations déséquilibrées du 17q Translocation déséquilibrée 17q 6 copies de HER2 Dr COUTURIER, Institut Curie, Paris

8 -8- Roche Cancéro -8- Roche Cancéro Est-ce que le statut HER2 est stable, ou peut être acquis au cours de lévolution tumorale ? Travail de Meng S PNAS 2004

9 -9- Roche Cancéro -9- Roche Cancéro Etude sur 33 patientes stade I à IV –Comparaison de lamplification HER2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive Puis même étude sur 24 patientes HER2 - Meng S, PNAS 2004

10 -10- Roche Cancéro -10- Roche Cancéro Le statut HER2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; Pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou Herceptin avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER2 positives. Etude initiale sur 33 patientes HER2-

11 -11- Roche Cancéro -11- Roche Cancéro 2 ème étude sur 24 patientes HER2- Evaluation sur CTC chez 24 patientes initialement HER2 « négatives » et en rechute –9 ont acquis un statut HER2 « positif » lors de la progression –Les 9 patientes ont alors reçu Herceptin ® 2RP et une RC

12 -12- Roche Cancéro -12- Roche Cancéro Critiques de létude Les niveaux damplification (rapport HER2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. Ceci est assez troublant car lamplification génique est un phénomène stable. Pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux damplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale ? Pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de lordre de 2.2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification).

13 -13- Roche Cancéro -13- Roche Cancéro Plusieurs hypothèses se discutent : –Le statut HER2 na pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) –La CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER2, ce qui expliquerait ces valeurs limites damplification – La cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER2, par sélection dun clone HER2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux damplification si bas ?

14 -14- Roche Cancéro -14- Roche Cancéro Si ces résultats sont confirmés, il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale, au niveau des métastases Conclusion

15 -15- Roche Cancéro -15- Roche Cancéro Cible des traitements anti HER-2 = protéine HER-2 exprimée à un haut niveau (IHC 3+) Surexpression à haut niveau d'HER-2 (3+) = liée à l'amplification du gène Les surreprésentations donnent des hyperexpressions de faible niveau Leur réponse au traitement n'est pas connue Objectif : détection des hyperexpressions/amplifications vraies Amplification Surexpression x10

16 -16- Roche Cancéro -16- Roche Cancéro Détermination du statut HER-2 par FISH Technique idéale gold-standard : - reproductibilité > à l'IHC - échecs identifiables (fixation BOUIN ++) - résultat sous forme d'une variable discontinue (numérique) Plusieurs limitations : - investissement en microscopie en fluorescence - coût plus élevé que l'IHC (210 ) - nécessité d'un personnel entrainé - fixation FORMOL ou Formol-Ac Acétique Indications : - calibration de l'IHC - détermination du statut des IHC 2+

17 -17- Roche Cancéro -17- Roche Cancéro Hybridation in situ principe Visualisation in situ du nombre de copies d'un gène Sur coupe à partir de tissu congelé, ou fixé Lecture en référence à l'histologie, –identification des structures invasives –intérêt par rapport aux méthodes moléculaires +++ La sonde visualisée soit par l'intermédiaire. d'un fluorochrome (FISH) technique de référence. d'un chromogène (CISH)

18 -18- Roche Cancéro -18- Roche Cancéro FISH HER-2 2 types de kits approuvés FDA - sonde HER-2 seule (Oncor/Ventana; Zymed) n. de copies HER-2 - sonde HER-2 + cent 17 (Vysis/Abott; Dako, …) rapport copies HER-2 / copies cent 17 Un impératif : distinguer les amplifications des sur-représentations

19 -19- Roche Cancéro -19- Roche Cancéro FISH HER-2 amplificationssur-représentations centromère 17HER-2 cent 17 HER-2 >10copies 6 copies

20 -20- Roche Cancéro -20- Roche Cancéro FISH HER-2 recommandations - HER-2: > 6 copies - HER2/cent 17: > 2.2 * Les amas de signaux (hsr) signent les amplifications. Donner les nombres de signaux HER-2 Vérifier HER-2/cent 17 en cas de 6-7 copies HER-2 Archiver les images (contrôle de qualité) *ASCO 2006, recommandations JCO Recommandation : afin de ne détecter que les amplifications vraies seuil ratio HER2/Cent 17 > 3

21 -21- Roche Cancéro -21- Roche Cancéro Cas non amplifiés 2 spots 5 spots CISH Dr ARNOULD, Dijon

22 -22- Roche Cancéro -22- Roche Cancéro Cas avec amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon

23 -23- Roche Cancéro -23- Roche Cancéro Faible amplification 6 spots Vérification par FISH du centromère du chr 17 CISH Dr ARNOULD, Dijon

24 -24- Roche Cancéro -24- Roche Cancéro Immunohistochimie : avantages Visualisation de la protéine in situ > spécificité de lévaluation de la surexpression > quantification de la protéine cible Largement répandue Sensible Automatisable et standardisable Faible coût Polyclonaux (A0485, Herceptest ® ), monoclonaux (CB11, Pathway TM de Ventana, SP3 de lapin …)

25 -25- Roche Cancéro -25- Roche Cancéro Cas (++) Faible niveau damplification 8 – 10 copies du gène

26 -26- Roche Cancéro -26- Roche Cancéro Cas (+++) Fort niveau damplification > 15 copies du gène

27 -27- Roche Cancéro -27- Roche Cancéro IHC : inconvénients Grande sensibilité Fixation inadéquate : altération des antigènes Pas de seuil de positivité consensus

28 -28- Roche Cancéro -28- Roche Cancéro Concordance statut HER2 FISH et IHC Si… 1.immunohistochimie calibrée 2.nombre de cas testés par an suffisant 90%

29 -29- Roche Cancéro -29- Roche Cancéro « Discordances » FISH / IHC amplification sans surexpression surexpression sans amplification < 10%

30 -30- Roche Cancéro -30- Roche Cancéro Pas damplificationPas de surexpression 65 à 80% des cas

31 -31- Roche Cancéro -31- Roche Cancéro Fort niveau damplificationSurexpression forte % à 30% des cas

32 -32- Roche Cancéro -32- Roche Cancéro Faible niveau damplification Surexpression modérée ++ 5% des cas dont : Pas damplification 40% 60%

33 -33- Roche Cancéro -33- Roche Cancéro Herceptest ® (Dako) Anticorps primaire polyclonal ( A0485) Sur tissus fixés en FORMOL neutre tamponné Réactifs prêts à lemploi Témoins : lignées cellulaires, nombre déterminé de copies HER2/neu Système de lecture standardisée

34 -34- Roche Cancéro -34- Roche Cancéro Comparaison Herceptest ® / FISH Jacobs : J Clin Oncol, 1999, 17, Pauletti : J Clin Oncol, 2000, 18, Lebeau : J Clin Oncol, 2001, 19, Tubbs : J Clin Oncol, 2001, 19, Perez : Mayo Clin Proc, 2002, 77, Dowsett : J Pathol, 2003, 199, Ainsworth : J Clin Path 2005, 58, –positivité faible (++): 6 à 87 % de faux positifs –positivité forte (+++): 6 à 25 % de faux positifs Peut être une trop grande sensibilité mais la dernière version du kit donne de très bons résultats –dans le respect strict des conditions de fixation non alcoolique, –lutilisation de témoins externes issus du laboratoire et dont le niveau damplification a été préalablement analysé –lapprentissage de linterprétation

35 -35- Roche Cancéro -35- Roche Cancéro Recommandations pour calibrer lIHC sur la FISH et maintenir la concordance entre les 2 techniques Arch Pathol Lab Med, 2003, 127, p 549 Modern Path, 2003, 16, p 173 Histopathology, 2003,42, p 337

36 -36- Roche Cancéro -36- Roche Cancéro Conditions de fixation, préparation des coupes Fixation optimale –en FORMOL neutre tamponné –moins d1h après la résection chirurgicale –moins de 48h –fragment de 0.5 à 1cm d épaisseur Préparation des blocs et coupes –conservation des blocs de paraffine à 20 à 25°C –réalisation des coupes idéalement moins dune semaine avant à °C au maximum 4 à 6 semaines avant la technique dimmunohistochimie à condition dun stockage à 4°C –3 à 5µm dépaisseur

37 -37- Roche Cancéro -37- Roche Cancéro Calibration de la technique Conditions de réaction calibrées sur FISH témoins lignées cellulaires pH du tampon de pré-traitement (pH : 6) Choix de lanticorps : monoclonal ou polyclonal Dilution de lanticorps primaire CB11 : 1/500 à 1/800 A0485 : 1/500 pour le formol 1/400 pour lAFA Adapter la dilution à chaque changement de technique, y compris entre deux automates identiques mais plus ou moins neufs (expérience de Claudius Regaud, Toulouse)

38 -38- Roche Cancéro -38- Roche Cancéro Témoins Utilisation de contrôles : –lignées cellulaires, fixées comme le tissu analysé –bloc multi-tissulaire (0, ++, +++) : nombre de copies connues par FISH Bloc choisi avec tissu normal, en évitant le tissu décalcifié Faux négatifs rares si pré-traitement par la chaleur

39 -39- Roche Cancéro -39- Roche Cancéro Glandes normales : témoin interne négatif de réaction Augmenter la dilution de lanticorps primaire si marquage des glandes normal

40 -40- Roche Cancéro -40- Roche Cancéro Fort niveau damplification Surexpression forte +++ Maladie de PAGET témoin positif de réaction

41 -41- Roche Cancéro -41- Roche Cancéro Témoin (++) amplifié (témoin intermédiaire très utile) À obtenir auprès dun centre expert FISH Sur un des cas du laboratoire (condition de fixation et préparation des blocs identiques aux cas à tester )

42 -42- Roche Cancéro -42- Roche Cancéro Calibrage de limmunohistochimie Contrôle de qualité interne (1) Pas de marquage des glandes normales Coupe dun bloc multi-tissulaire inclus à chaque manipulation : –forte amplification (forte surexpression) –amplification modérée (intensité modérée) –pas damplification (pas de marquage)

43 -43- Roche Cancéro -43- Roche Cancéro Calibrage de limmunohistochimie contrôle de qualité interne (2) Fréquence des cas positifs : 15 à 30% Retester 5% des cas positifs et négatifs / an –CURIE en 2005: 24 cas 3+: 100% concordance avec la FISH –4 cas 8 copies HER2 –18 cas > 10copies –2 cas NI 19 cas négatifs 100% concordance avec la FISH

44 -44- Roche Cancéro -44- Roche Cancéro Métastase HER2+++ En cas de surexpression de HER2 sur la tumeur primaire Tumeur primaire bronchiquemédullaire

45 -45- Roche Cancéro -45- Roche Cancéro HER2 et récepteurs hormonaux corrélation inverse Lal et al Am J Clin Pathol 2005 Koneckny JNCI 2003 Taucher et al Cancer 2003 Huang et al, Annals of Oncology, 2005 HER2 IHC+++ ou FISH positif HER2 négatif RO +10 à 49%80% RP +8 à 24%53%

46 -46- Roche Cancéro -46- Roche Cancéro Calibrage de limmunohistochimie contrôle de qualité externe : Résultats à vérifier par FISH / CISH Entraînement et formation du personnel Tests nationaux (AFAQAP) 1 test / an européen (UK NEQAS)4 tests / an

47 -47- Roche Cancéro -47- Roche Cancéro Indications de la détermination du statut de HER2 En 2007, idéalement : –au diagnostic initial de carcinome infiltrant (ASCP 2006) !! Ou bien : –Patientes métastatiques –N+ –N- avec critères de prescription de chimiothérapie adjuvante et/ou dhormonothérapie adjuvante

48 -48- Roche Cancéro -48- Roche Cancéro Regrouper les manipulations Validation –vérification de la conformité des témoins externes, –détermination du niveau de lintensité de la manipulation du jour ++++ Interprétation des cas par le médecin ayant signé le diagnostic. En pratique

49 -49- Roche Cancéro -49- Roche Cancéro Interprétations Prendre en compte –Le marquage membranaire –Le % de cellules carcinomateuses infiltrantes –Lintensité du marquage Pas de seuil validé sur la réponse au traitement

50 -50- Roche Cancéro -50- Roche Cancéro Le score 0Absence de marquage ou < 30% des cellules non +Marquage faible et incomplet de >30% de cellules non ++Marquage faible ou modéré et complet de >30% de cellules Oui seulement si amplification prouvée par FISH +++Marquage fort et complet de > 30% des cellules oui Indication HerceptinScoreMarquage

51 -51- Roche Cancéro -51- Roche Cancéro Surexpression hétérogène de HER2 situation exceptionnelle TESTER LA METASTASE GANGLIONNAIRE ou VISCERALE

52 -52- Roche Cancéro -52- Roche Cancéro non 0 2+ oui 1+ non marquage membranaire complet > 30% cellules Algorithme test HER2 IHC non 20x ou 40x oui 3+ 10x marquage membranaire complet

53 -53- Roche Cancéro -53- Roche Cancéro 2+ Retester par FISH ou CISH – Algorithme général test HER2 Réf. : HERA, BCIRG, NSABP B31, FIN HER Tumeur mammaire IHC 3+ Traitement anti HER2 + Traitement anti HER2 – HER2/Cent 17 1,8 2,2 compter plus de cellules en FISH ou retester en IHC Statut HER2 équivoque FISH / CISH + Traitement anti HER2

54 -54- Roche Cancéro -54- Roche Cancéro Conclusion HER2 surexprimé dans ~ 15-20% des cancers du sein Thérapeutique anti HER2 spécifique Analyse de HER2 par immunohistochimie APRES CALIBRAGE sur la FISH fiable rapide standardisable contrôle de qualité indispensable

55 -55- Roche Cancéro -55- Roche Cancéro IHC Aspects méthodologiques

56 -56- Roche Cancéro -56- Roche Cancéro Exemple du Protocole Curie Septembre 2006 Echantillons tissulaires fixés en AFA, coupes à 3µm Démasquage antigénique par dénaturation thermique dans 400 ml tampon citrate 10 mM à pH 6,1, pendant 20 Anticorps CB11 (Novocastra), dilué au 1/800 – Préparation de la dilution par un référent technique, 62.5 µl de lAC primaire CB11 Novocastra (ref NCL-CB11), dans 50ml de diluant ZYMED (ref ), aliquoté en tube de 5 ml stériles, stockés à 4 ° dans le réfrigérateur de la pièce dimmunomarquage, – un aliquot est utilisé à chaque manipulation, à sortir sur GLACE pour préparation de la manipulation. –Incubation 60 min –Automate LABVISION Révélation : complexe ABC Vectastain Elite de chez Vector Contrôle externe : bloc composé de 4 tissus (3+ amplifié à plus de 10 copies, 2+ amplifié à 8 copies, 0 à 2 copies et un fragment de glandes normales)

57 -57- Roche Cancéro -57- Roche Cancéro Exemple du Protocole centre Jean Perrin Clermont-Ferrand Echantillons tissulaires fixés en AFA, coupes 3 µm Démasquage antigénique dans tampon citrate pH 6.0 (réf: ChemMate S2031 Dako) pendant 40 min au Bain Marie à 97°C puis 20 min sur la paillasse à température ambiante Anticorps Ventana clone 4B5 prédilué (réf: ) temps de pose de lanticorps 28 min avec lautomate Nexes de Ventana Révélation par le kit iView DAB Détection Ventana (réf: ) avec lautomate Nexes

58 -58- Roche Cancéro -58- Roche Cancéro Exemple du Protocole centre René-Huguenin Saint Cloud Echantillons tissulaires fixés en AFA, coupes 3 µm Démasquage antigénique dans tampon citrate pH 6.0 pendant 40 min au Bain Marie à 95°C puis 20 min sur la paillasse à température ambiante Anticorps polyclonal Dako (A0485) temps de pose de lanticorps 30 min, automate Autostainer Dako Révélation par le kit DAB Dako (réf: K5001) Contrôle externe punch 3+, 2+, 0 contrôlés par Fish

59 -59- Roche Cancéro -59- Roche Cancéro Exemple du Protocole Institut Paoli Calmette Echantillons tissulaires fixés en FA, coupes à 3 µm Démasquage antigénique par Bain Marie(95-99°) tampon KIT Herceptest TM pH6 pendant 40, refroidir 20 Anticorps polyclonal de lapin prédilué KIT Herceptest TM (30) prêt à lemploi non aliquoté Autostainer (DAKO) Révélation :DAB/KIT Contrôle externe TMA avec 3+,2+,0 contrôlés en FISH

60 -60- Roche Cancéro -60- Roche Cancéro Généralités Anticorps = Protéine de haut PM (Famille des glycoprotéines) Conformation complexe de la protéine fragilité Compromis de la fixation : morphologie et antigénicité Fixation et démasquage: un couple à optimiser

61 -61- Roche Cancéro -61- Roche Cancéro Durée de fixation Le délai avant fixation le plus court Durée de fixation 24 à 48H

62 -62- Roche Cancéro -62- Roche Cancéro Fixation Choix du fixateur Délai de fixation Taille de léchantillon Volume pièce / volume de fixateur

63 -63- Roche Cancéro -63- Roche Cancéro Fixateur Solution de formaldéhyde à 4% dans sa forme tamponnée Idéale pour FISH et IHC (pontant) A.F.A (alcool formaldéhyde, acide acétique) (coagulant) Bon compromis entre morphologie et antigénicité

64 -64- Roche Cancéro -64- Roche Cancéro Déshydratation-Imprégnation Leau contenue dans les tissus sera progressivement remplacée par la paraffine (Ethanol puis Toluène ou xylène..) Infiltration des échantillons par la paraffine (ou mélange paraffine + polymères) à 56-58°C (point de fusion de la paraffine !!! Attention à la paraffine trop chaude >60°C) afin préserver certaines propriétés chimiques et limmunoréactivité

65 -65- Roche Cancéro -65- Roche Cancéro Séquence des solvants Ethanol4h Toluène5h Paraffine3h58°C* Pour un cycle de nuit12h Séquence automatisée vide / pression/T° programme spécial pour le week-end en prolongeant létape la moins délétère : TOLUENE (12 heures ou plus) ENROBAGE en paraffine : température aussi à 58°C +++

66 -66- Roche Cancéro -66- Roche Cancéro Étalement-Séchage Coupes de 3µ sur bain deau distillée à °C, décontaminé le soir !!!! ou Sur plaques chauffantes progressives +++ Lames spéciales (+système adhésif) Drainer sur champ à température ambiante Sécher 1h à 58° puis une nuit à 37°+++ dans létuve ventilée ( thermomètre de contrôle à lintérieur)

67 -67- Roche Cancéro -67- Roche Cancéro Microtome dédié et piscine thermostatée et lumineuse

68 -68- Roche Cancéro -68- Roche Cancéro Déparaffinage ++++ Séquence automatisée: Toluène 3 x (5minutes)15 min Ethanol 100%, 95%, 80% 6 min. Eau déminéralisée2 min. RENOUVELLEMENT DES BAINS REGULIEREMENT un bain par jour !!

69 -69- Roche Cancéro -69- Roche Cancéro Démasquage au micro-ondes 7000 euros…..!!!! Sinon rien ou bain marie

70 -70- Roche Cancéro -70- Roche Cancéro Les cuves du four micro-ondes

71 -71- Roche Cancéro -71- Roche Cancéro Démasquage au bain-marie Puis 20 minutes précises dans le tampon sur la paillasse 40 minutes à 97°C (thermomètre !!)

72 -72- Roche Cancéro -72- Roche Cancéro Tampon citrate à faire soi même ou tout prêt (chez DAKO par ex) Acide citrique 1mM (solution A) Tris sodium citrate 1mM (solution B) 14 ml de A + 86ml de B + eau distillée qsp 1000ml = solution de travail Le pH est ajusté à par addition de HCl ou NaOH

73 -73- Roche Cancéro -73- Roche Cancéro Le pH mètre un investissement indispensable

74 -74- Roche Cancéro -74- Roche Cancéro Anticorps utilisés Polyclonal : grande sensibilité A485 Monoclonal : grande spécificité CB11, SP3 (lapin), Ventana (clone 4B5) Reconnaissant un des domaines externe ou interne de HER2

75 -75- Roche Cancéro -75- Roche Cancéro Pipetage Apprendre à pipeter juste avec des Pipettes contrôlées. Précision, fidélité et justesse!! Maintenance tous les ans (joints détanchéité) Au labo : tous les 2 mois par pesées –1000µl = 1gr et 500µl= 0,5g, (trois mesures ) –Cônes stériles+++ –Précision du pipetage : contrôle visuel lors du pipetage

76 -76- Roche Cancéro -76- Roche Cancéro Dilution La plus élevée possible - pas de marquage des glandes normales Détecter uniquement la surexpression (glandes normales négatives) Étalonnée par rapport à la FISH Les dilutions sont ajustées en fonction du lot danticorps. (annexes exemples FPL )

77 -77- Roche Cancéro -77- Roche Cancéro Prévention des contaminations Utilisation de gants et de matériel à usage unique Utilisation de diluant pour anticorps du commerce (surfactant et bactéricide)

78 -78- Roche Cancéro -78- Roche Cancéro « Aliquotage » Limiter la fréquence des pipetages Les dilutions danticorps primaires sont réalisées à distance de la manipulation par un technicien responsable. Chaque lot danticorps dilué fait le lobjet dune vérification du titre Garder la feuille de lANTICORPS (n° du LOT à noter sur le flacon ainsi que la date douverture) Préparer les aliquots par ex CB11 NOVOCASTRA : un tube stock aliquoté ajusté en fonction de la dilution que lon utilise et de la consommation du laboratoire. Lanticorps dilué se conserve moins bien (moins d1 semaine) Les aliquots sont conservés congelés à -20°C 100µl minimum sinon risque de dessication (>6MOIS)

79 -79- Roche Cancéro -79- Roche Cancéro Tous les réactifs (PBT, PBS…), sont préparés stérilement en dose unique En dehors des produits prêts à lemploi des automates type Benchmarck, Ventana…

80 -80- Roche Cancéro -80- Roche Cancéro Kits de révélation AC-BIOTINE<>AVIDINE (exemple: ABC de VECTOR, Ventana) Polymères (de dextran; exemple : Envision…)

81 -81- Roche Cancéro -81- Roche Cancéro Regroupement des demandes Pour lanalyse en série (minimum de 10 cas à la fois) Regroupement des techniques HER2 pour des structures avec recrutement plus faible Optimisation du temps technique et préparation des réactifs Introduction de lames témoins externes à chaque manipulation DATER les lames dune même manip (lot de lames techniquées)

82 -82- Roche Cancéro -82- Roche Cancéro Automatisation de la séquence Autostainer Benchmark Bond max etc...

83 -83- Roche Cancéro -83- Roche Cancéro Avantage de lautomatisation Standardisation Pas de consommable spécifique Ouverture à tout les système détection Intervention possible du technicien en cas de problème Grande capacité

84 -84- Roche Cancéro -84- Roche Cancéro Lames témoins Des coupes multi-tissulaires issues de blocs dont le statut du gène HER2 est connu (FISH) Sinon accessibilité de la FISH (à rechercher auprès des centres de référence ++++) Prendre au minimum des glandes normales et une maladie de PAGET ou un Carcinome in situ de haut grade HER2 +++) Elles sont utilisées dans chaque série analysée Lames datées à chaque manipulation et conservées au laboratoire, accessibles à tous Ne pas couper les lames trop longtemps avant la manipulation (idéalement une semaine avant), à conserver à +4°C à labri de la poussière

85 -85- Roche Cancéro -85- Roche Cancéro Choix des zones dintérêt

86 -86- Roche Cancéro -86- Roche Cancéro Forage des blocs donneurs

87 -87- Roche Cancéro -87- Roche Cancéro Confection du bloc multi-tissulaire témoins externes

88 -88- Roche Cancéro -88- Roche Cancéro Témoin négatif Glandes normales Témoin positif de réaction Maladie de PAGET Utilisation de témoins

89 -89- Roche Cancéro -89- Roche Cancéro Expression forte Score : 3+ Marquage complet et intense Expression modérée Score : 2+ Vérification du statut du gène/FISH Critères dinterprétation des cas positifs Faible niveau damplification 8 – 10 copies du gène Fort niveau damplification > 15 copies du gène

90 -90- Roche Cancéro -90- Roche Cancéro Feuille de paillasse Un exemple

91 -91- Roche Cancéro -91- Roche Cancéro Commentaires de manipulation et de validation

92 -92- Roche Cancéro -92- Roche Cancéro Dialogue médecins & techniciens TRAVAIL MAIN DANS LA MAIN Feuilles de manip, commentaires de validation des témoins

93 -93- Roche Cancéro -93- Roche Cancéro remerciements À léquipe qui la réalisé Anne Vincent Salomon Institut Curie Paris André Nicolas Institut Curie Paris Jérôme Couturier Institut Curie Paris Matthieu Roche Centre Jean Perrin Clermont Ferrand Et à ceux qui ont bien voulu le relire Laurent Arnould Centre Georges François Leclerc Dijon Jean-Marc Guinebretière Centre René Hugenin St Cloud Jocelyne Jacquemier Centre Paoli Calmettes Marseille Frédérique Penault Llorca Centre Jean Perrin Clermont Ferrand Magali Lacroix Centre Claudius Regaud Toulouse Gaetan Mac Grogan, Institut Bergonié Bordeaux

94 -94- Roche Cancéro -94- Roche Cancéro Le statut HER2 ne serait pas stable et pourrait être acquis au cours de lévolution tumorale Meng S PNAS 2004

95 -95- Roche Cancéro -95- Roche Cancéro Meng S, PNAS patientes stade I à IV Comparaison de lamplification HER2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive Puis même étude sur 24 patientes HER2 -

96 -96- Roche Cancéro -96- Roche Cancéro Etude initiale sur 33 patientes Le statut HER2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou anti HER2 avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER2 positives.

97 -97- Roche Cancéro -97- Roche Cancéro 24 HER2- Ils ont alors évalué le statut HER2 sur CTC chez 24 patientes initialement HER2 « négatives » en rechute. Parmi ces 24 patientes, 9 ont acquis un statut HER2 « positif » lors de la progression Les 9 patientes ont alors reçu un traitement anti HER2: 2RP et une RC

98 -98- Roche Cancéro -98- Roche Cancéro Critiques de létude Les niveaux damplification (rapport HER2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. Ceci est assez troublant car lamplification génique est un phénomène stable. Il est difficile de comprendre pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux damplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale. Par ailleurs, pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de lordre de 2.2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification).

99 -99- Roche Cancéro -99- Roche Cancéro Plusieurs hypothèses se discutent : –soit le statut HER2 na pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) –soit la CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER2, ce qui expliquerait ces valeurs limites damplification ; – soit la cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER2, par sélection dun clone HER2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux damplification si bas ?

100 -100- Roche Cancéro Roche Cancéro Si ces résultats sont confirmés, il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale au niveau des métastases


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