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Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer)

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1 Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer) CNRS - Université Louis Pasteur Strasbourg Tel: Introduction

2 Plan Mercredi 12/10 : Les Bases de la Spectrométrie de Masse (Sarah Sanglier) - Introduction à la spectrométrie de masse - Lionisation MALDI - Lionisation Electrospray Vendredi 14/10 : Application à lanalyse protéomique (Alain Van Dorsselaer)

3 Définitions 1- Présentation dun spectre de masse 2- Unité de mesure: le Dalton 3- Masse moléculaire monoisotopique 4- Masse moléculaire moyenne (ou chimique) Linstrument : structure dun appareil de spectrométrie de masse 1-Structure dun instrument : source et analyseur 2- Rôle des champs lélectrostatiques 3- Rôle et systèmes de génération du vide 4- Présentation des principales sources EI, FAB, MALDI, ESI 5- Présentation des principaux analyseurs Magnétique, quadrupôlaire, trappe dion, TOF, FT-ICR 6- La MS-MS Spectrométrie de masse : introduction générale

4 Quest-ce que la spectrométrie de masse ? Cest une méthode de mesure des rapports masse-sur-charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées et de leurs produits de fragmentations

5 1- La masse moléculaire dun composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité m/z Pic Moléculaire Fragments Nombre dions Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ?

6 Pic moléculaire et masse moléculaire : définition La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire dans le spectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les atomes de la molécule étudiée, sans quil y ait eu rupture dune liaison. La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain dune charge électrique. La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire (formule brute) de lion moléculaire. Lexistence disotopes se traduit par la présence de plusieurs pics moléculaires. On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics moléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire ») La présence disotopes complique donc la définition, et la mesure du « pic moléculaire ».

7 1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire 2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure 3- Lintensité des pics permet de faire de lanalyse quantitative Fragments Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ? Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.

8 Masse monoisotopique cest la masse du premier pic du profil isotopique cest-à-dire celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C 12, H 1, O 16, S 32, N 14, …). Masse chimique ou moyenne cest le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le profil isotopique cest-à-dire la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011). Quelle masse mesure-t-on ?

9 Pic monoisotopique P P+1 P+2P+3 m/z Masse moyenne Quelle masse mesure-t-on ? Masse monoisotopique:dans le massif isotopique, on lappelle le pic P Les autres pics du massif isotopique sont appelés les pics P+1, P+2, P+3,…. Il contiennent tous au moins 1 des isotopes lourds dun éléments.

10 La résolution mesure laptitude dun analyseur à séparer lion M de lion M+ M Vallée à 10 % M M + M M R = M/ M De quoi dépend la nature de la masse mesurée ?

11 Pic monoisotopique P P+1 P+2P+3 m/z Masse moyenne Quelle masse mesure-t-on ?

12 La masse m sexprime en Dalton (Da) 1 Da = 1/ kgmole -1 / N (N = 6, ) Et donc:1 Da = 1, kg Quelle sont les unités de mesure ? C 12 = 12, C 13 = 13, H 1 = 1, H 2 = 2, O 16 = 15, S 32 = 31, N 14 = 14, Cl 35 = 34, Cl 37 = 36,

13 Un spectrométre de masse mesure la masse de molécules isolées Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes: 1- Volatiliser Séparer les molécules les unes des autres: on passe de létat de matière condensée à un état gazeux. 2- Ioniser Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne grâce à des champs électriques 3- Mesurer les rapports m/z La masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse (m)/nb de charges (z)

14 Un spectromètre de masse est constitué de: Source obtention d ions en phase gazeuse Interface focalisation et transmission des ions Analyseur séparation des ions en fonction de m/z

15 Un spectromètre de masse est donc constitué de deux parties : 1- La source dion : pour volatiliser et ioniser Ces opérations peuvent se faire simultanément ou successivement selon le type de source dions. Leur mécanisme intime est souvent mal connu. 2- Lanalyseur: pour mesurer m/z Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z) Cest une partie de lappareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans lappareil pour atteindre le détecteur. CECI IMPLIQUE: Des champs électrostatiques très précis pour guider et déplacer les ions dans l'appareil (lentilles électrostatiques, optique ionique) Un vide suffisant pour que les ions puissent se déplacer sans être détruits ou déviés par des molécules résiduelles (notion de libre parcours moyen)

16 Les unités de mesures des pressions sont nombreuses. Lunité officielle est le pascal (Pa): 1 pascal = 1 N/m 2 On utilise également: Latmosphère1 atm = Pa (soit 1 013,25 hecto Pa) et 1 atm = 1,013 bar Le bar1 bar = 10 5 Pa (=10 6 dyne/cm2) Le millibar1 millibar = bar = 10 2 Pa Le Torr1 Torr = 1mm Hg Le Psi1 Psi = 1 pound / square inch = 0,07 atm et 14 PSI = 1 atm Pour la plupart des spectromètres de masse, le vide est indiqué en millibar. Les valeurs du vide dans lanalyseur sont en général: mbar :pour un analyseur trappe ionique (orbite circulaire) mbar :pour un analyseur quadripôlaire (1 mètre de long) mbar :pour un analyseur magnétique (2 à 3 mètres de long) mbar :pour un analyseur à temps de vol (2 à 3 mètres de long) mbar :pour un analyseur ICR (orbite circulaire).

17 Il existe de nombreux types de sources dions et chacun de ces types de sources repose sur un principe physique différent. Le principe physique qui permet de volatiliser et lioniser un type de composé est choisi par lopérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapes de volatilisation et dionisation se font successivement ou simultanément selon le type de source. Les critères de choix principaux sont: la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser sa labilité chimique les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation la taille des molécules les quantités de produit disponibles le type dintroduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique) La source dions : son rôle est de volatiliser et dioniser

18 De très nombreuses méthodes dionisation ont été inventées pour ioniser et volatiliser des molécules de plus en plus fragiles, grandes et polaires. Les « ionisations dures » génèrent souvent des ions moléculaires, à nombre impair délectrons, qui se fragmentent beaucoup et parfois même totalement avant davoir eu le temps de sortir de la source. Lorsque leur durée de vie est assez longue pour quil sortent de la source intacts, mais quils se décomposent avant davoir complètement traversé lanalyseur et darriver au détecteur, on les appelle ions métastables. Leurs fragments peuvent être analysés et donnent des informations de structures. Les « ionisations douces » génèrent des ions moléculaires à nombre pair délectrons, qui sont relativement stables et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverser lanalyseur, arriver jusquau détecteur, et donc être mesurés. Les sources dions se classent en sources « dures » et en sources « douces »

19 1- La masse moléculaire dun composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité Quelles informations peut apporter une source à ionisation dure ? Pic Moléculaire M/z Fragments Nombre dions

20 1- La masse moléculaire dun composé 2- Pas de fragmentation 3- Une mesure de la quantité Quelles informations peut apporter un soure à ionisation douce ? Pic Moléculaire M/z Nombre dions

21 Les sources dions les plus courantes sont : La source à plasma induit couplé (Induced coupled plasmas: ICP-MS)Très dure La source à impact électronique (EI)Dure La source à ionisation chimique (CI)Assez douce La source à ionisation chimique par désorption (DCI)Assez douce Lionisation par thermospray (TSP)Assez douce La désorption de champs (FD)Assez douce Lionisation par bombardement dions ou datomes rapides (LSIMS, FAB)Assez douce La désorption par plasma (PD)Assez douce La désorption laser (LD)Assez douce Lionisation chimique à pression atmosphérique (API ou APCI)Assez douce La photoionisation (APPI)Assez douce Lionisation laser assistée par matrice (MALDI) Utilisées en Douce Lélectronébulisation (electrospray: ES ou ESI) PROTEOMIQUE Douce

22 Lanalyseur : pour mesurer m/z B:Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien) Q: Déflexion par un champ quadrupolaire IT: Confinement dans un piège à ion (Ion Trap) TOF:Mesure dun temps de vol (Time Of Flight) FT-ICR:Résonnance Cyclotronique dIons à Transformée de Fourrier Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers lanalyseur par des champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans lanalyseur dépend de lintensité du champ dextraction On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MS n ) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir séparateur de chaque analyseurs. Ceux-ci peuvent être identiques ou différents. Il existe différents types danalyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents, mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z. Cest une partie de lappareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans lappareil pour atteindre le détecteur.

23 Les caractéristiques principales d'un analyseur sont : La résolution R La gamme m/z qu'il peut analyser La rapidité de balayage en m/z La sensibilité La vitesse avec laquelle les ions le traversent Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces caractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans certaines limites. Chaque type d'analyseur a son "point fort".

24 Caractéristiques des analyseurs AnalyseursRésolutionGamme m/z Quadripôle (Q) Magnétique (EB) Temps de vol (TOF) Trappe ionique Cyclotron à résonance des ions (FT-ICR)

25 Spectromètres de masse commerciaux: De nombreux couples source /analyseur sont possibles EI/CI FAB MALDI/LD ES/APCI Q BE TOF IT FT-ICR

26 Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon séquentielle. On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/z On purifie donc un ion présent dans un mélange dion qui peut être très complexe Lion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision. Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments. Cest de la MS-MS (spectrométrie de masse en tandem) Si on répète lopération, on fait de la MS-MS-MS ou MS 3 Certain appareils permettent de faire de la MS 10 La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions: Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent

27 Principe de la MS/MS: étude dions fils MS1 MS2 Cellule de collision Détecteur Source Ions Ion parent Fragmentation (CID) Ions fils Spectre MS/MS Le premier analyseur ne balaye pas

28 Principe de fragmentation dans la chambre de collision (Collision Induced Dissociation : CID) Cellule de collision V E c = E lab = ze V E cm = E lab m g / Mi + m g Mi, z mgmg m1m1 m2m2 m3m3

29 Les analyseurs MS n La MS-MS peut être réalisée par : Deux quadrupôlesQ-Q Un quadrupôle et un analyseur à temps de vol Q-TOF Deux analyseurs à temps de volTOF-TOF Un piège à ions (Ion Trapp) IT Une résonnance cyclotronique dion à transformée de FourrierFT-ICR La MS n peut être réalisée par : Un piège à ions (Ion Trapp) IT Une résonnance cyclotronique dions à transformée de FourrierFT ICR

30 Les énergies de la collision en MS/MS dépendent du type danalyseur utilisé. Collision haute énergie en keV EB/EB ou BEB EB/Q EB/TOF TOF/TOF TOF (PSD) Collision basse énergie en eV QQ Q-TOF IT FT-ICR On peut obtenir des schémas de fragmentation différents selon les énergies utilisées

31 Nomenclature des fragments peptidiques Fragments observés seulement en haute énergie CH RnRn CO NHCH R n+1 anan bnbn cncn xnxn ynyn znzn NH COOH dn, vn, wndn, vn, wn d n+1, v n+1, w n+1 Fragments observés en haute et basse énergie Bieman, Roepstorff, Fohlmann

32 x10 4 Intens , Spectre ESI-MS dun digeste trypsique (m/z=681) MS/MS

33 ESI-IT-MS-MS de lion [M+2H] 2+ à m/z=681 I/L A G E K D


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