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BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 1 Méthodes de séquençage dADN Rappel : ADN, Clonage, Électrophorèse Méthode chimique de Maxam et.

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1 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 1 Méthodes de séquençage dADN Rappel : ADN, Clonage, Électrophorèse Méthode chimique de Maxam et Gilbert Méthode enzymatique de Sanger Détails des techniques utilisées au début des années 1990 Séquençage de grands fragments : marche sur le chromosome, sous-clonage, etc. Automatisation Méthode Shotgun

2 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 2 Rappel sur lADN Base azotéeDésoxyribosePhosphate

3 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 3 Enzymes de restriction

4 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 4 Clonage dADN

5 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 5 Clonage dADN

6 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 6 Principe de lélectrophorèse

7 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 7 Exemple délectrophorèse

8 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 8 Méthode de Maxam et Gilbert

9 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 9 Méthode de Maxam et Gilbert

10 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 10 Méthode de Maxam et Gilbert

11 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 11 ADN polymérase 5 3

12 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 12 Méthode de Sanger

13 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 13 Méthode de Sanger 1.Préparation dune grande quantité dADN (~1 g via miniprep) Dénaturation et ajoût de lamorce, des 4 dNTP (dont 1 radioactif, S 35 ou P 32 ) et de lADN polymérase Faire 4 aliquots et mettre un peu de ddNTP dans chaque tube Elongation et terminaison par incorporation de didéoxynucléotides spécifiques

14 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 14 Méthode de Sanger 5.Préparation du gel du polyacrylamide Dénaturation et dépôt sur gel Migration par électrophorèse ddGddAddTddC

15 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 15 Méthode de Sanger 8.Transfert du gel sur papier filtre (Whatman 3MM) Séchage du gel Cassette autoradiographique (+ écran amplificateur) Développement du film autoradiographique Lecture sur table lumineuse Saisie sur ordinateur Longueur typique de lecture : 400 nucléotides Durée totale de lexpérience : environ 3 jours

16 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 16 Séquençage de grands fragments Marche sur le chromosome 10 kpb Synthèse de 2 * 10 amorces Durée totale du séquençage : > 11 * 3 jours Qualité des séquences Lecture double brin ~ 3 mois

17 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 17 Séquençage de grands fragments Sous-clonage 10 kpb ~ 5 enzymes de restriction à 6 nucléotides (HindIII, EcoRI, BamHI, PstI, SmaI) Carte de restriction pour décider quelles enzymes retenir Sous-clonage avec BamHI des 8 fragments BamHIPstIBamHISmaIBamHIPstIBamHISmaIBamHI SmaIEcoRIBamHI Durée totale du séquençage : ~ 5 * 3 jours

18 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 18 Séquençage de grands fragments Digestion avec une exonucléase 10 kpb 2 enzymes de restriction (5 sortant et 5 rentrant) Polylinker Insert Plasmide ……… Prélévements toutes les ~30, ligation, clonage, séquençage ~10 jours

19 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 19 Étapes limitantes du séquençage Temps, coûts, difficulté de robotiser : Obtention de lADN (miniprep) Autoradiographie : 12h à des jours Couler les gels Détermination et fabrication des amorces (marche sur le chromosome) Sous-clonage

20 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 20 Polymerase Chain Reaction PCR

21 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 21 Utilisation des fluorochromes Cycle sequencing

22 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 22 Utilisation des fluorochromes

23 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 23 Capillaires

24 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 24 Séquençage par shotgun

25 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 25 Séquençage par shotgun

26 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 26 Evolution de la vitesse de séquençage Année#réactions/pers onne/semaine Longueur moyenne de lecture #nucléotides/personne/semaine

27 BIN1001, H2005, Hervé Philippe, Université de Montréal 27 Construction dune carte de restriction


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