Analyse conformationnelle de solutés par RMN en milieu faiblement orientant et modélisation moléculaire Maria Enrica Di Pietro, Christie Aroulanda Denis.

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1 Analyse conformationnelle de solutés par RMN en milieu faiblement orientant et modélisation moléculaire Maria Enrica Di Pietro, Christie Aroulanda Denis Merlet & Giuseppina De Luca 1

2 enjeu dans l’évaluation et le développement de nouveaux médicaments
Analyses structurale et conformationnelle de molécules anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS) Relations structure-activité : activité biochimique influencée par : ▪ structure 3D ▪ distribution conformationnelle pour un solvant donné enjeu dans l’évaluation et le développement de nouveaux médicaments Structures voisines de l’aspirine Structures voisines de l’ibuprofène Acide phénylsalicylique Flurbiprofène * (R,S) Diflunisal 2

3 Analyses structurale et conformationnelle de molécules anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS)
Diflunisal Acide phénylsalicylique Solvants cristal-liquides variés (thermotropes & lyotropes, faiblement & fortement orientant), Influence de la nature du solvant modèles de solvants isotropes de diverses natures Présence d’atomes de fluor Influence sur la géométrie et/ou la distribution conformationnelle? 3

4 Des solvants cristaux liquides faiblement orientant
CHCl3, CH2Cl2 THF, 1,4-dioxane Pyridine DMF polymère co-solvant poly-g-benzyl-L-glutamate (PBLG) phase cristal liquide nématique chirale 4

5 Des informations supplémentaires sur les spectres RMN
(i) molécules rigides milieu liquide spectres RMN à haute résolution Ɵij rij n Jij diiso djiso j i Observables RMN anisotropes milieu cristal-liquide Tij dianiso djaniso anisotropies de déplacement chimique éclatements quadripolaires (I ≥ 1) COUPLAGES DIPOLAIRES couplage spin-spin total Tij = Jij + 2Dijexp(noyaux non eq.) Tij = 3Dijexp (noyaux eq.) informations sur l’ORIENTATION, la STRUCTURE 5

6 Des informations supplémentaires sur les spectres RMN
(ii) molécules flexibles milieu liquide spectres RMN à haute résolution Ɵij rij n Jij diiso djiso j i Observables RMN anisotropes milieu cristal-liquide Tij dianiso djaniso COUPLAGES DIPOLAIRES couplage spin-spin total Tij = Jij + 2Dijexp(noyaux non eq.) Tij = 3Dijexp (noyaux eq.) informations sur l’ORIENTATION, la STRUCTURE et la CONFORMATION 6

7 Des informations supplémentaires sur les spectres RMN
(ii) molécules flexibles Approche « Mean-Field » : le soluté est le siège d’un potentiel soluté-solvant ULC lorsqu’il est dans son orientation W et dans une conformation décrite par  Nul dans un solvant isotrope Contient le couplage conformation/orientation comparaison Pthéo() Piso () décrit la distribution conformationnelle du soluté dans un solvant virtuel de mêmes propriétés physico-chimiques que le solvant orienté utilisé, à l’exclusion de sa capacité à induire une orientation 7

8 Des informations supplémentaires sur les spectres RMN
(ii) molécules flexibles Additive Potential « AP-model » modèles Uext & Uint Maximum Entropy « ME-model » « AP-DPD model » modèle En pratique : Echantillonnage de la PES; seuls les N conformères majeurs sont pris en compte dans la description de l’orientation finale observée du soluté 8

9 Application du modèle AP-DPD au diflunisal : Uext
coefficients 2,m() conformation-dépendents amplitude : fonction de la « force » anisotrope de l’interaction soluté/solvant développé sous la forme : Contribution de chaque sous-unité rigide j au potentiel Uext Nombre de paramètres 2,p(j) par sous-unité rigide j fonction de sa symétrie INCONNUS à déterminer a b εringA2,0 εringA2,2 εringB2,0 εringB2,2 εCF2,0 εCC2,0 A B J. W. Emsley, G. R. Luckhurst, C. P. Stockley, Proc. Roy. Soc. A, (1982) 381, 117 9

10 Application du modèle AP-DPD au diflunisal : Uint
Modélisation habituelle/historique dans les thermotropes Direct Probability Distribution (DPD) φ avec 1max, 2max, h1 = h2 & A1 (A2 = 1 - A1) INCONNUS à déterminer 2couples de 2 conformères G. Celebre, G. De Luca, J.W. Emsley, E.K. Foord, M. Longeri, F. Lucchesini, G. Pileio, J. Chem. Phys., (2003) 118, 61417 10

11 Modélisation moléculaire du diflunisal
trans φ= +43.2 P =30% cis φ= P =20% cis φ= P =20% trans φ= -43.2 P =30% φ=C4C5C7C8 Legame H Optimisation de géométrie, puis scan rigide de la PES (DFT B3LYP/6-31++G**, in vacuo, G09) φ 11

12 détermination de la distribution conformationnelle via la PES : Ptheo()
comparaison AP-DPD traitement du couplage de la distribution conformationnelle du soluté avec sa distribution orientationnelle Piso() RMN dans des solvants cristal-liquide (faiblement orientant) 12

13 Piso() AP-DPD 10 inconnues 40 Dijexp: 21 sur le cycle A
9 sur le cycle B 10 entre les cycles AP-DPD 13

14 Analyses structurale et conformationnelle du diflunisal
14

15 Analyses structurale et conformationnelle du diflunisal
φ1max /° 45.5±2.1 φ2max /° 41.1±1.2 h1=h2 /° 10.5±1.8 A1 0.56±0.02 εringA2,0 /RT -0.03±0.01 εringA2,2 /RT -0.02±0.01 εCF2,0 /RT ± εringB2,0 /RT 0.04±0.01 εringB2,2 /RT -0.018±0.005 εCC2,0 /RT 0.0087±0.0005 RMS 0.35 trans φ= +45.5 P =28% cis φ= P =22% cis φ= P =22% trans φ= -45.5 P =28% Piso(φ) 15

16 Analyses structurale et conformationnelle du diflunisal
trans φ= +45.5 P =28% cis φ= P =22% cis φ= P =22% trans φ= -45.5 P =28% Piso(φ) Ptheo(φ) 16

17 Piso() AP-DPD 7 inconnues 27 Dijexp: 10 cycle A 13 cycle B
4 inter-cycles AP-DPD 17

18 Effet des atomes de fluor sur la distribution conformationnelle
Acide phénylsalicylique φ = 140.4° φ = ° φR = -39.6° φ = 39.6° P = 0.25 φ Piso() Résultats expérimentaux RMS = 0.32 φmax /° 39.6±15.4 h1=h2 /° 27.5±2.5 (after parameterization) εringA2,0 /RT -0.005±0.002 εringA2,2 /RT ±0.0009 εringB2,0 /RT 0.009±0.002 εringB2,2 /RT ±0.0008 εCC2,0 /RT 0.0064±0.0002 RMS 0.31 φ = 140.6° φ=-140.6° φ = -39.4° φ = 39.4° P = 0.25 φ Pthéo() Calculs théoriques DFT B3LYP/6-31++G** 18

19 Effet des atomes de fluor sur la distribution conformationnelle
Acide phénylsalicylique φ = 140.4° φ = ° φR = -39.6° φ = 39.6° P = 0.25 φ Piso() Résultats expérimentaux RMS = 0.32 φ Piso() φ = 138.9° φ= ° φ = -45.5° φ= 45.5° P = 0.28 0.22 RMS = 0.35 Diflunisal 19

20 Conclusions & Perspectives
Piso(φ) Ptheo(φ) Illustration de l'efficacité de la RMN dans les solvants cristaux liquides faiblement orientant pour l’analyse conformationnelle de molécules biologiquement actives Première application du modèle AP-DPD dans ces solvants Piso(φ) diflunisal acide phenylsalicylique Etude de l’influence des atomes de fluor sur la distribution conformationnelle φ1 φ2 plusieurs rotors indépendants ou couplés un centre stéréogène Application de la méthodologie à d'autres AINS possédant : ϑ/° φ/° Piso (ϑ, φ) Naproxène * (S) Flurbiprofène * (R,S) 20

21 21

22 Etude RMN du Diflunisal
Spectres RMN 1D & 2D 1H, 13C & 19F (Bo = 9.4 T) en abondance naturelle de: Diflunisal THF PBLG Diflunisal THF-d8 d / ppm 19F 1H H4 H12 H6 H9+H11+H3 H2 F10 F8 1H 19F d / ppm H4 H12 H6 H9+H11+H3 H2 F10 F8 Jij Tij Dijexp 22

23 Etude RMN du Diflunisal
THF PBLG ▪ spectres 1H et 19F compliqués 1H 19F d / ppm H4 H12 H6 H9+H11+H3 H2 F10 F8 ▪ mais DHF indispensables nouvelle expérience GET-SERF M. E. Di Pietro, C. Aroulanda, D. Merlet, J. Magn. Reson., (2013) 234, 101 23

24 Data for diflunisal i j Jijiso (Hz) Tijobs (Hz) Dijexp(Hz)
Dijcalc (Hz) C-H couplings C3 H3 162.9 ± 0.2 222.8 ± 0.6 30.0 ± 0.4 30.0 H4 0.0 ± 0.2 -18.0 ± 0.6 -9.0 ± 0.4 -10.0 C4 160.0 ± 0.2 110.2 ± 0.6 -24.9 ± 0.4 -24.8 H6 8.7 ± 0.2 9.6 ± 0.6 0.5 ± 0.4 1.1 C6 7.9 ± 0.2 8.4 ± 0.6 0.3 ± 0.4 0.4 162.5 ± 0.2 226.1 ± 0.6 31.8 ± 0.4 31.7 C9 H9 165.9 ± 0.2 175.2 ± 0.6 4.7 ± 0.4 4.4 H11 5.5 ± 0.2 7.1 ± 0.6 0.8 ± 0.4 C11 166.0 ± 0.2 193.6 ± 0.6 13.8 ± 0.4 13.8 C12 H12 162.8 ± 0.2 170.1 ± 0.6 3.7 ± 0.4 4.1 C-F couplings C8 F8 ± 0.3 ± 0.6 8.0 ± 0.5 8.3 F10 12.0 ± 0.3 9.3 ± 0.6 -1.4 ± 0.5 -1.3 26.3 ± 0.6 20.1 ± 0.6 -3.1 ± 1.1 -3.4 -3.2 C10 12.1 ± 0.3 11.3 ± 0.6 -0.4 ± 0.5 -0.4 ± 0.3 ± 0.6 -32.7 ± 0.5 -32.5 4.7 ± 0.3 6.5 ± 0.6 0.9 ± 0.5 0.9 9.4 ± 0.3 -1.5 ± 0.5 -1.5 24

25 i j Jijiso (Hz) Tijobs (Hz) Dijexp(Hz) Dijcalc (Hz)
H-H couplings H3 H4 8.6 ± 0.1 -36.4 ± 0.4 -22.5 ± 0.3 -23.0 H6 0.5 ± 0.1 4.5 ± 0.4 2.0 ± 0.3 1.3 2.4 ± 0.1 5.2 ± 0.3 1.4 ± 0.2 1.7 H9 0.0 ± 0.1 -2.9 ± 0.4 -1.5 ± 0.3 -1.1 H11 0.0 ± 0.1 -1.0 H12 -5.0 ± 0.2 -2.5 ± 0.2 -2.3 -4.5 ± 0.4 -2.3 ± 0.3 -2.4 -2.2 -10.1 ± 0.3 -5.1 ± 0.2 -5.4 2.6 ± 0.1 7.2 ± 0.2 2.3 ± 0.2 2.2 8.7 ± 0.1 -35.7 ± 0.4 -22.2 ± 0.3 -22.1 25

26 i j Jijiso (Hz) Tijobs (Hz) Dijexp(Hz) Dijcalc (Hz)
H-F couplings H4 F8 1.7 ± 0.1 0 ± 0.5 -0.9 ± 0.3 -0.7 F10 0.0 ± 0.5 -2.1 ± 0.5 -1.1 ± 0.5 H6 1.5 ± 0.1 -11.1 ± 0.5 -6.3 ± 0.3 -6.6 0.0 ± 0.5 -3.9 ± 0.5 -2.0 ± 0.5 -1.6 H9 10.9 ± 0.1 -26.8 ± 0.5 -18.9 ± 0.3 -18.3 9.1 ± 0.1 14.4 ± 0.5 2.7 ± 0.3 2.1 H11 -1.0 ± 0.1 0.5 ± 0.3 0.5 8.1 ± 0.1 7.0 ± 0.5 -0.6 ± 0.3 -1.0 H12 9.0 ± 0.1 12.8 ± 0.5 1.9 ± 0.3 1.8 6.4 ± 0.1 1.9 ± 0.5 -2.3 ± 0.3 -2.6 F-F couplings 7.2 ± 0.2 4.1 ± 0.4 -1.6 ± 0.3 -1.5 26

27 DFL in PBLG/THF DFL in PBG/THF
φ1max (degree) 45.5 ± 2.1 45.2 ± 2.1 φ2max (degree) 41.1 ± 1.2 41.6 ± 1.1 h1 = h2 (degree) 10.5 ± 1.8 10.7 ± 2.2 A1 0.56 ± 0.02 0.56 ± 0.05 εringA2,0 (RT) -0.03 ± 0.01 ± 0.003 εringA2,2 (RT) -0.02 ± 0.01 ± 0.002 εCF2,0 (RT) ± ± εringB2,0 (RT) 0.04 ± 0.01 0.026 ± 0.003 εringB2,2 (RT) ± 0.005 ± 0.001 εCC2,0 (RT) ± ± RMS 0.35 0.43 27

28 40 Dijexp A B 21 for ring A 9 for ring B 10 inter-ring Dijexp / i,j Hz
NMR DATA 21 for ring A 9 for ring B 10 inter-ring 40 Dijexp A B i,j Dijexp / Hz H4-F8 -0.9 ± 0.3 H3-H4 -22.5 ± 0.3 H11-H12 -22.2 ± 0.3 C3-H3 30.0 ± 0.4 H4-F10 -1.1 ± 0.5 H3-H6 2.0 ± 0.3 C8-F8 8.0 ± 0.5 C3-H4 -9.0 ± 0.4 H6-F8 - 6.3 ± 0.3 H4-H6 1.4 ± 0.2 C8-F10 -1.4 ± 0.5 C4-H4 -24.9 ± 0.4 H6-F10 -2.0 ± 0.5 H4-H9 - 1.5 ± 0.3 C9-F8 -3.1 ± 1.1 C4-H6 0.5 ± 0.4 H9-F8 -18.9 ± 0.3 H4-H11 C9-F10 C6-H4 0.3 ± 0.4 H9-F10 2.7 ± 0.3 H4-H12 - 2.5 ± 0.2 C10-F8 -0.4 ± 0.5 C6-H6 31.8 ± 0.4 H11-F8 0.5 ± 0.3 H6-H9 - 2.3 ± 0.3 C10-F10 -32.7 ± 0.5 C9-H9 4.7 ± 0.4 H11-F10 -0.6 ± 0.3 H6-H11 C12-F8 0.9 ± 0.5 C9-H11 0.8 ± 0.4 H12-F8 1.9 ± 0.3 H6-H12 -5.1 ± 0.2 C12-F10 -1.5 ± 0.5 C11-H11 13.8 ± 0.4 H12-F10 -2.3 ± 0.3 H9-H11 2.3 ± 0.2 F8-F10 -1.6 ± 0.3 C12-H12 3.7 ± 0.4 28

29 inter-cycles A B φ1max /° 45.5 ± 2.1 φ2max /° 41.1 ± 1.2 h1 = h2 /° 10
i,j Dijexp / Hz DijAP-DPD / Hz H25-H27 2.3 ± 0.2 2.2 C14-F26 -3.1 ± 1.1 -3.2 H27-H28 -22.2 ± 0.3 -22.1 H15-H22 2.0 ± 0.3 1.3 H25-F24 -18.9 ± 0.3 -18.3 H15-H23 1.4 ± 0.2 1.7 H25-F26 2.7 ± 0.3 2.1 H22-H23 -22.5 ± 0.3 -23.0 H27-F24 0.5 ± 0.3 0.5 C4-H15 31.8 ± 0.4 31.7 H27-F26 -0.6 ± 0.3 -1.0 C4-H23 0.3 ± 0.4 H28-F24 1.9 ± 0.3 1.8 C7-H15 0.5 ± 0.4 1.1 H28-F26 -2.3 ± 0.3 -2.6 C7-H23 -24.9 ± 0.4 -24.8 F24-F26 -1.6 ± 0.3 -1.5 C8-H22 30.0 ± 0.4 30.0 C10-H28 3.7 ± 0.4 4.1 C8-H23 -9.0 ± 0.4 -10.0 C11-H27 13.8 ± 0.4 13.8 H15-F24 - 6.3 ± 0.3 - 6.6 C14-H25 4.7 ± 0.4 4.4 H15-H25 - 2.3 ± 0.3 - 2.4 C14-H27 0.8 ± 0.4 H15-F26 -2.0 ± 0.5 -1.6 C10-F24 0.9 ± 0.5 0.9 H15-H27 - 2.2 C10-F26 -1.5 ± 0.5 H15-H28 -5.1 ± 0.2 -5.4 C12-F24 -0.4 ± 0.5 -0.4 H23-F24 -0.9 ± 0.3 -0.6 C12-F26 -32.7 ± 0.5 -32.5 H23-H25 - 1.5 ± 0.3 - 1.1 C13-F24 8.0 ± 0.5 8.3 H23-F26 -1.1 ± 0.5 -0.7 C13-F26 -1.4 ± 0.5 -1.3 H23-H27 - 1.0 C14-F24 -3.4 H23-H28 - 2.5 ± 0.2 - 2.3 A B inter-cycles φ1max /° 45.5 ± 2.1 φ2max /° 41.1 ± 1.2 h1 = h2 /° 10 A1 0.56 RMS 0.35 29

30 inter-cycles A B i,j Dijexp/Hz H25-H27 2.3 ± 0.2 C14-F26 -3.1 ± 1.1
-22.2 ± 0.3 H15-H22 2.0 ± 0.3 H25-F24 -18.9 ± 0.3 H15-H23 1.4 ± 0.2 H25-F26 2.7 ± 0.3 H22-H23 -22.5 ± 0.3 H27-F24 0.5 ± 0.3 C4-H15 31.8 ± 0.4 H27-F26 -0.6 ± 0.3 C4-H23 0.3 ± 0.4 H28-F24 1.9 ± 0.3 C7-H15 0.5 ± 0.4 H28-F26 -2.3 ± 0.3 C7-H23 -24.9 ± 0.4 F24-F26 -1.6 ± 0.3 C8-H22 30.0 ± 0.4 C10-H28 3.7 ± 0.4 C8-H23 -9.0 ± 0.4 C11-H27 13.8 ± 0.4 H15-F24 - 6.3 ± 0.3 C14-H25 4.7 ± 0.4 H15-H25 - 2.3 ± 0.3 C14-H27 0.8 ± 0.4 H15-F26 -2.0 ± 0.5 C10-F24 0.9 ± 0.5 H15-H27 C10-F26 -1.5 ± 0.5 H15-H28 -5.1 ± 0.2 C12-F24 -0.4 ± 0.5 H23-F24 -0.9 ± 0.3 C12-F26 -32.7 ± 0.5 H23-H25 - 1.5 ± 0.3 C13-F24 8.0 ± 0.5 H23-F26 -1.1 ± 0.5 C13-F26 -1.4 ± 0.5 H23-H27 C14-F24 H23-H28 - 2.5 ± 0.2 A B inter-cycles 30

31 Application de la séquence RMN GET-SERF au diflunisal
TH6F8 TH4F8 = 0 Hz TH12F8 TH4H12 TH4H12 H9 H9 +H11 +H11 +H3 +H3 H6 H12 THF δH H4 TH12F8 TH9F8 TH3F8 = 0 Hz TH4H12 TH6F8 TH4H12 TH11F8 = 0 Hz texp = 13 min M. E. Di Pietro, C. Aroulanda, D. Merlet, J. Magn. Reson., (2013) 234, 101 31

32 Data for phenylsalicylic acid
j Jijiso (Hz) Tijobs (Hz) Dijexp(Hz) Dijcalc (Hz) C-H couplings C1 H3 5.3 ± 0.3 6.6 ± 0.6 0.7 ± 0.5 0.7 H4 0 ± 0.3 -2.0 ± 0.6 -1.0 ± 0.5 -0.5 C3 162.1 ± 0.3 213.9 ± 0.6 25.9 ± 0.5 25.6 -11.6 ± 0.6 -5.8 ± 0.5 -5.7 C4 158.1 ± 0.3 115.5 ± 0.6 -21.3 ± 0.5 -21.3 H6 8.1 ± 0.3 9.3 ± 0.6 0.6 ± 0.5 C6 -1.2 ± 0.5 0 ± 0.6 0.6 ± 0.6 0.6 7.1 ± 0.3 7.4 ± 0.6 0.2 ± 0.5 0.1 160.4 ± 0.3 211.6 ± 0.8 25.6 ± 0.5 25.9 C8 H8 159.1 ± 0.3 192.0 ± 0.8 16.5 ± 0.5 16.8 C9 H9 161.3 ± 0.3 195.1 ± 0.6 16.9 ± 0.5 16.7 C10 8.2 ± 0.6 4.1 ± 0.5 4.0 H10 160.9 ± 0.3 102.4 ± 0.8 -29.3 ± 0.5 -30.0 H11 C11 C13 4.5 ± 0.3 -2.3 ± 0.5 -2.3 32

33 i j Jijiso (Hz) Tijobs (Hz) Dijexp(Hz) Dijcalc (Hz)
H-H couplings H3 H4 8.6 ± 0.1 -12.8 ± 0.4 H6 0.5 ± 0.1 3.3 ± 0.4 2.5 ± 0.1 4.7 ± 0.4 H8 0 ± 0.1 -4.1 ± 0.4 H12 -11.3 ± 0.4 H9 -3.2 ± 0.6 H10 -2.9 ± 0.6 H11 7.8 ± 0.1 -13.7 ± 0.6 1.2 ± 0.1 0 ± 0.6 0.7 ± 0.1 2.4 ± 0.6 1.4 ± 0.1 5.8 ± 0.6 7.4 ± 0.1 18.0 ± 0.6 6.0 ± 0.6 33