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Étude structurale dun complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae, DivIB, DivIC et FtsL Soizic MASSON Directeurs de thèse : André Zapun,

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1 Étude structurale dun complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae, DivIB, DivIC et FtsL Soizic MASSON Directeurs de thèse : André Zapun, Frank Gabel et Thierry Vernet Thèse pour lobtention du grade de Docteur de lUniversité Joseph Fourier Grenoble 1 Préparée au Laboratoire dIngénierie des Macromolécules

2 Présentation du plan Introduction Contexte biologique Présentation du modèle utilisé Résultats I. Le complexe contraint EC/KL II. La partie extracellulaire de DivIB III. Linteraction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB Conclusion, perspectives, collaborations 1/44

3 Les règnes du vivant Introduction / Contexte biologique Eucaryote: « à noyau » Procaryote Sarcodina (Amibe) Streptococcus pneumoniae Methanococcus jannischii 2/44

4 Les bactéries Introduction / Contexte biologique Une bactérie est un organisme unicellulaire Membrane plasmique Peptidoglycane Membrane externe (Gram négatif) ADN 3/44

5 Les bactéries Introduction / Contexte biologique 3/44 Gram positif Une bactérie est un organisme unicellulaire Membrane plasmique ADN Peptidoglycane

6 La division bactérienne Introduction / Contexte biologique Les bactéries se reproduisent par division: une cellule mère donne 2 cellules filles identiques 4/44

7 La division bactérienne Introduction / Contexte biologique FtsZ FtsAFtsKDivIBDivICFtsLFtsW FtsI Constriction membrane Ségrégation chromosome Synthèse paroi septale Fonction inconnue 5/44 Plusieurs protéines impliquées dans la division :

8 La division bactérienne Introduction / Contexte biologique FtsZFtsAFtsK DivIB DivIC FtsL FtsWFtsI Ordre de recrutement chez E. coli Ordre de recrutement similaire chez B. subtilis, supposé équivalent chez S. pneumoniae Constriction membraneSégrégation chromosome Synthèse paroi septale 5/44 Plusieurs protéines impliquées dans la division :

9 FtsL Introduction / Contexte biologique Chez S. pneumoniae: FtsL 57 aa 23 aa 25 aa Le gène est -présent dans la plupart de génomes bactériens, -transcrit avec FtsI (synthèse de la paroi septale). La protéine est -essentielle à la survie de la plupart des bactéries, -peu stable face à la dégradation in vivo, -un substrat de la protéase YluC. N-ter 6/44 Cyt. Ext.

10 Introduction / Contexte biologique DivIC Chez S. pneumoniae: 68 aa 23 aa 33 aa Le gène est -présent dans la plupart de génomes bactériens. La protéine est -essentielle à la survie de la plupart des bactéries. N-ter DivIC 7/44 Cyt. Ext.

11 FtsL et DivIC Introduction / Contexte biologique 23 aa Les deux protéines -se protègent mutuellement de la dégradation, -se co-localisent mutuellement, -présentent un motif de « coiled-coil », -interagissent in vivo et in vitro. 8/44 FtsL N-ter DivIC Cyt. Ext.

12 DivIB Introduction / Contexte biologique Chez S. pneumoniae: Le gène est -présent dans la plupart de génomes bactériens. La protéine est -nest pas essentielle à la survie du pneumocoque -protége FtsL de la dégradation, -semble liée à la synthèse du peptidoglycane. 248 aa 23 aa 125 aa DivIB La partie extracellulaire est -composée de 3 domaines (2 structures proposées). N-ter 9/44 Cyt.

13 La partie extracellulaire de DivIB Introduction / Contexte biologique Chez E. coli:Chez G. stearothermophilus: Code PDB: 1YR1 α β ( ) Code PDB: 2VH1Robson et al., 2006Van den Ent et al., /44

14 FtsL, DivIC et DivIB Introduction / Contexte biologique Très peu de conservation dans les séquences primaires Les trois protéines interagissent : -protection de FtsL par DivIB, -co-localisation mutuelle, -interaction prouvée in vitro et in vivo 11/44 DivIB N-ter FtsL N-ter DivIC Cyt. Ext.

15 La division bactérienne Introduction / Contexte biologique DivIB DivIC FtsL FtsWFtsI Structure supposée en « coiled-coil » Topologie déterminée Structures résoluesStructure résolue Constriction membrane FtsZFtsAFtsK Ségrégation chromosomes Synthèse paroi septale 2 structures proposées du domaine extracellulaire Plusieurs protéines impliquées dans la division : 12/44

16 Objectifs du travail Introduction / Objectif du travail But de cette thèse: apporter des informations structurales sur - DivIB, DivIC et FtsL, - les complexes quelles forment, - larrangement de chacune dans ces complexes, - leur interface dinteraction. 13/44

17 Présentation du modèle utilisé Introduction / Présentation du modèle utilisé DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae : Très peu de conservation dans les séquences primaires, notamment dans les parties cytoplasmiques => Étude sur les parties extracellulaires seules 14/44 DivIB N-ter FtsL N-ter DivIC Cyt. Ext.

18 Présentation du modèle utilisé Introduction / Présentation du modèle utilisé DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae : IB Pas dinteraction Rôle des segments transmembranaires de DivIC et FtsL ? 14/44 N-ter C L

19 K E Présentation du modèle utilisé Introduction / Présentation du modèle utilisé DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae : Formation dun complexe entre la partie extracellulaire de DivIC et celle de FtsL 14/44 C L

20 IB Présentation du modèle utilisé Introduction / Présentation du modèle utilisé DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae Interaction avec la partie extracellulaire de DivIB Validation du système modèle Noirclerc-Savoye et al., /44 K L E C

21 Outils utilisés Introduction / Objectif du travail Outils biophysiques utilisés: - RMN (étude structurale préliminaire et analyse de structuration), - SANS et SAXS (détermination du degré doligomérisation et modélisation basse résolution), - BIA par SPR (cartographie de zone dinteraction et détermination de constantes cinétiques). 15/44

22 Présentation du plan Introduction Contexte biologique Présentation du modèle utilisé Résultats I. Le complexe contraint EC/KL II. La partie extracellulaire de DivIB III. Linteraction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB Conclusion, perspectives, collaborations

23 EC/KL, un hétéro complexe I. Le complexe contraint EC/KL EC Strep KL His6 Les protéines EC et KL: Co-élution : SDS-PAGE 16/44

24 EC/KL, un hétéro complexe I. Le complexe contraint EC/KL Spectre HSQC de KL 15 N dans le complexe EC/KL: Peu de pics se distinguent du bruit, problème de sensibilité 17/44

25 EC/KL, un hétéro complexe, tétramérique I. Le complexe contraint EC/KL Etude par SANS: Le complexe EC/KL est un tétramère, (EC/KL) 2 Conc (mg/ml)Mapp (kDa) 1057 ± ± 9 1,550 ± 14 M (EC/KL) 1 = 25 kDa Détermination de la masse: I(0) = f 1. M. c 18/44

26 EC/KL, un hétéro complexe, allongé I. Le complexe contraint EC/KL Etude par SANS: Le complexe (EC/KL) 2 a une forme allongée, similaire à un bâton long Estimation de la fonction de distribution de distances: 19/44 EC/KL Cylindre Sphère

27 EC/KL, un hétéro complexe, en équilibre I. Le complexe contraint EC/KL Etude par SAXS: Le complexe (EC/KL) 2 se dissocie en (EC/KL) 1, avec un K D denviron 25 M Détermination de la masse: I(0)= f 2. M. c 20/44

28 Conclusions sur le complexe contraint EC/KL I. Le complexe contraint EC/KL Le tétramère à la forme dun bâton allongé; Le complexe EC/KL est en équilibre entre un tétramère et un dimère; La constante de dissociation du tétramère en dimère est environ 25 µM. Le tétramère de EC/KL reflète-t-il une réalité physiologique? 21/44

29 Présentation du plan Introduction Contexte biologique Présentation du modèle utilisé Résultats I. Le complexe contraint EC/KL II. La partie extracellulaire de DivIB III. Linteraction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB Conclusion, perspectives, collaborations

30 II. La partie extracellulaire de DivIB La partie extracellulaire de DivIB Spectre HSQC de IB 15 N : La partie extracellulaire de DivIB est structurée, en partie IB 22/44

31 IB est composée de trois domaines II. La partie extracellulaire de DivIB Protéolyse limitée de IB: La partie extracellulaire de DivIB est organisée en trois domaines, dont le domaine central est résistant à la trypsine + séquençage N-Ter et analyse en spectrométrie de masse IB α γ β 23/44

32 Spectre HSQC de β 15 N : II. La partie extracellulaire de DivIB Étude du domaine β par RMN β => Bon candidat pour une étude par RMN 24/44

33 Les constructions utilisées pour étudier IB II. La partie extracellulaire de DivIB Élaboration de différentes constructions détude: IB 25/44

34 Les constructions utilisées pour étudier IB II. La partie extracellulaire de DivIB Élaboration de différentes constructions détude: Étude comparée par SAXS Trop peu stable face à la dégradation Étude par RMN α γ β 25/44

35 Étude du domaine β par SAXS II. La partie extracellulaire de DivIB Courbe de diffusion de β de S. pneumoniae: β 26/44

36 Étude du domaine β par SAXS II. La partie extracellulaire de DivIB Courbe de diffusion de β : β de G. stearothermophilus β de E. coli 27/44

37 Étude du domaine β par SAXS II. La partie extracellulaire de DivIB Courbe de diffusion de β : Le domaine β de S. pneumoniae est structuralement proche du domaine β dE. coli β 27/44 β G. stearothermophilus β E. coli β S. pneumoniae

38 II. La partie extracellulaire de DivIB Étude des domaines βγ par SAXS Courbe de diffusion de βγ: Modélisation ab initio β γ 28/44

39 II. La partie extracellulaire de DivIB Étude des domaines βγ par SAXS Modèle ab initio de βγ: 29/44

40 II. La partie extracellulaire de DivIB Étude des domaines βγ par SAXS Modèle ab initio de βγ: Le domaine β de S. pneumoniae enveloppe bien celui dE. coli 1. Le domaine γ est modélisé par une boule en C-Ter du domaine β 1 La structure représentée du domaine β dE. coli comprend les acides aminés de la valine 127 à la proline 260 de la structure 2VH1 29/44

41 II. La partie extracellulaire de DivIB Étude des domaines αβγ (IB) par SAXS Courbe de diffusion de αβγ: α β γ 30/44

42 II. La partie extracellulaire de DivIB Étude des domaines αβγ (IB) par SAXS Courbe de diffusion de αβγ: La présence doligomères dans les échantillons de αβγ empêche la modélisation de la partie extracellulaire de DivIB α β γ 30/44 β S. pneumoniae βγ S. pneumoniae αβγ S. pneumoniae

43 II. La partie extracellulaire de DivIB Conclusions sur la partie extracellulaire de DivIB Le domaine central (β) est structuralement proche du domaine dE. coli; Le domaine C-ter (γ) est modélisé par une petite boule accrochée à une extrémité du domaine centrale; Le domaine N-ter (α) est peu stable face à la dégradation et induit des oligomères. La partie extracellulaire de DivIB est organisée en trois domaines; 31/44

44 II. La partie extracellulaire de DivIB Discussion sur la partie extracellulaire de DivIB Quelle est la longueur réelle du domaine central, β, de la partie extracellulaire de DivIB? 32/44

45 Présentation du plan Introduction Contexte biologique Présentation du modèle utilisé Résultats I. Le complexe contraint EC/KL II. La partie extracellulaire de DivIB III. Linteraction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB Conclusion, perspectives, collaborations

46 La partie extracellulaire de DivIB complexée avec EC/KL III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Spectre HSQC de IB (ou αβγ) 15 N : IB 33/44

47 IB III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Le complexe est de grande taille et le domaine β est impliqué dans linteraction Addition de EC/KL non marqué Spectre HSQC de IB (ou αβγ) 15 N : La partie extracellulaire de DivIB complexée avec EC/KL 33/44

48 Détermination de lépitope dinteraction sur β III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Spectre HSQC de β 15 N et 2 H : β 34/44

49 Détermination de lépitope dinteraction sur β III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Addition de EC/KL non marqué Des résidus de β impliqués dans linteraction avec EC/KL sont identifiés Spectre HSQC de β 15 N et 2 H : β β 34/44

50 Détermination de lépitope dinteraction sur β III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Représentation de lépitope dinteraction de β de S. pneumoniae avec EC/KL, sur la structure de β dE. coli 1 : 1 Cette représentation repose sur un alignement des séquences primaires de DivIB de S. pneumoniae, de G. stearothermophilus et dE. coli réalisé par alignement des éléments structuraux des protéines de G. stearothermophilus et dE. coli 35/44

51 Linteraction de EC/KL avec la partie extracellulaire de DivIB III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Faible sensibilité des spectres HSQC => anisotropie importante du complexe ? Délimitation de régions C-terminales de DivIC et de FtsL : (sur la base de la prédiction de la formation dun « coiled-coil ») IB EC L K 36/44

52 III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Test dinteraction des complexes tronqués avec βγ: EC/KLEC*/KL Les régions C-terminales de DivIC et FtsL sont essentielles à linteraction avec βγ Cartographie des régions dinteraction de EC/KL par Biacore 37/44 EC/KL*

53 III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Détermination des constantes dinteraction par Biacore EC/KL La constante de dissociation du complexe βγ/EC/KL est de 220 nM Interaction de βγ à différentes concentrations avec EC/KL: 38/44

54 Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Détermination de la masse de mélange de βγ et EC/KL: I(0) = f 1. M. c 39/44 βγ : EC/KL0 : 11 : 11 : 0

55 Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Détermination de la masse de mélange de βγ et EC/KL: I(0) = f 1. M. c 39/44 βγ : EC/KL0 : 11 : 11 : 0 I(0) ( )201 ± ± 1085 ± 9

56 Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Détermination de la masse de mélange de βγ et EC/KL: I(0) = f 1. M. c βγ : EC/KL0 : 11 : 11 : 0 I(0) ( )201 ± ± 1085 ± 9 M app (kDa)55,4 ± 8,346,2 ± 6,122,3 ± 4,6 M dimère = 25 39/44 55,4 ± 8,3 22,3 ± 4,646,2 ± 6,1 => lassociation de βγ avec le complexe EC/KL dissocie le tétramère ?

57 Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Simulation de composition des échantillons: 0,27 mM => Courbe de diffusion de βγ/EC/KL ! 40/44

58 Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Courbe de diffusion de βγ/EC/KL: => Modelisation ab initio 41/44

59 Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Modélisation basse résolution de βγ/EC/KL: 42/44

60 Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Modélisation basse résolution de βγ/EC/KL: βγ semble se localiser à lextrémité du complexe EC/KL 42/44

61 Conclusions sur linteraction entre IB et EC/KL III. Étude sur linteraction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL Les régions C-terminales de DivIC et de FtsL sont essentielles à linteraction avec la partie extracellulaire de DivIB Des résidus du domaine central de la partie extracellulaire de DivIB sont impliqués dans linteraction avec les parties extracellulaires de DivIC et de FtsL Les domaines central et C-terminal se localisent à lextrémité du complexe EC/KL 43/44

62 Conclusion générale et perspectives DivIB :- tester limportance relative des résidus de lépitope dinteraction, DivIB/DivIC/FtsL : - augmenter la résolution du modèle basse résolution. DivIC/FtsL : - identifier les résidus critiques des régions C-terminales, 44/44

63 Collaborations Institut de Biologie Structurale: LRMN: Jean-Pierre SimorreLEM:Nicole Thielens Thomas KernJean-Pierre Andrieu Cécile Guistini LBM: Christine Ebel LSMP: Bernard Dublet Aline AppourchauxEric Forest LPM: Isabelle PetitRoBioMol: Benoit Gallet Marjolaine Noirlerc-Savoye LIM: tous! Institut Laue Langevin: D-Lab: Michael Haertlein Martine Moulin D22: Phill Callow European Synchrotron Radiation Facility: ID02: Anuj Shukla Theyencheri Narayanan Stéphanie Finet

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