PLAN I. Support et organisation de l'IG

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1 PLAN I. Support et organisation de l'IG
II. Mécanismes moléculaires de conservation de l'IG III. Mécanismes moléculaires de l'expression de l'IG IV. Transmission de l'IG lors de la mitose

2 I. Support et organisation de l'IG
A. Support moléculaire de l'IG B. Organisation fonctionnelle des génomes C. Support cellulaire de l'IG

3 A. Support moléculaire de l'IG : les acides nucléiques
B. Organisation fonctionnelle des génomes 1- Le génome bactérien : circulaire

4 1- Le génome bactérien : circulaire
a) Condensation dans le nucéloïde - Taille pb - Double hélice (double brin) - Par superenroulement (topoisomérase ajoute ou défait les vrillages : <0 naturellement; >0 artificiciellement ou temporaire) -  2 à 4 copies du chromoïde (dans cellule en croissance) - Associé à protéines (différentes des histones eucaryotes)

5 a) Condensation dans le nucléoïde
b) Cartographie du génome  Mesure des cinétiques de réassociation de l'ADN

6 Cinétique de réassociation de l'ADN dC/dt = -kC2
C : concentration des séquences simple brin au temps t k : constante d'association Noter le 0 de l'axe des ordonées et la représentation logarithmique de l'axe des abscisses

7 dont 7 codant pour ARNr et prot ribosomiales (proche oriC).
 Toutes les séquences chez E. coli sont uniques (4,2.106 bp) 900 gènes dont 7 codant pour ARNr et prot ribosomiales (proche oriC).

8 les gènes bactériens peuvent être polycistroniques : ex opéron lactose

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10 - Cas des Plasmides ( 50/cell)
codent pour gènes qui confèrent proprio particulières Ex : conjugaison ; émission de pili sexuels ; résistance aux antibiotiques etc. Mésosome

11 a) Condensation dans le nucéloïde
b) Cartographie du génome c) Fluidité du génome : les gènes sauteurs Mee sur Maïs (couche à aleurone bigarrée) par Barbara Mac Clintock

12 c) Fluidité du génome : les gènes sauteurs
- mécanisme : IR inversée répétés encadrant séquence codant pour une transposase (ne s'exprime qu'une fois et déclenche insertion sur zone cible de la copie, le transposon mère reste à sa place

13 c) Fluidité du génome : les gènes sauteurs
-  transposons plus complexes Ex : Tn1688 avec deux transposons simples encadrant le gène de la toxine thermostable d'E.coli. - Conséquence : mutations, inactivation ou réactivation de gènes (cancerigenèse)

14 B. Organisation fonctionnelle des génomes
1- Le génome bactérien : circulaire 2- Le génome extranucléaire : mitochondrial et chloroplastique a) Des molécules circulaires c1) Cas des chloroplastes nt 2 séquences répétées et inversées (25000 pb) encadrent une séquence unique courte (Short Single Copy, pb) et une séquence unique longue (Long Single Copy, pb) c2) Cas des mitochondries pb chez levures pb chez humains - Introns chez levures (ex. cytochrome b = 6 cytochrome oxydase = 7 Pas chez humains

15 5 mm et 16569pb chez l'Homme (mais chez levure! ) 107 daltons (très petit par rapport aux pb nucléaire) 300 et 500 mitochondries / cell. environ 100 molécules d’ADN mt / mito.

16 a) Des molécules circulaires
b) Coopération génome nucléaire / extranucléaire c2) Cas des mitochondries ex de l'ATPsynthétase des mitochondries (et chloroplastes) - dans Fo : I et III chloroplastiques; II cytoplasmique - dans F1 : a, b, e chloroplastiques; g, d cytoplasmiques c1) Cas des chloroplastes - ex des photosystèmes - antenne collectrice : cytoplasmique - PSI et PSII : chloroplastiques

17 1- Le génome bactérien circulaire 2- Le génome extranucléaire
3- L'ADN génomique des Eucaryotes : linéaire, surenroulé en chromosome a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées

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19  rôle? - Interprétation
- Chez Procaryotes et génome extranucléaire, tout l'ADN est fonctionnel (temps proportionnel à complexité et nb de pb) - Chez Eucaryotes il existe une grande partie du génome non transcrit  rôle?

20 Séquences fortement répétées
- Très petites taille (= 60 pb) - Fonction? - 2 Types : - séquences dispersées (régulateurs de transcription?) - séquences regroupées :

21 ADN satellite : - disposition distinguable en gradient de ClCs - Séquences riches en A (GAAAAA...) Séquences télomériques : - Dans régions terminales de l'ADN - (TTTGGG)n fois  hétérochromatine : (10% du l'ADN) toujours condensée, même pendant interphase; séquences constitutives des - centromères, - centre organisateurs nucléolaires

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24 Séquences moyennement répétées
 Séquences à fonction inconnue : - SINE = Short INterspersed Éléments de 200 à 300 pb - LINE = Long INterspersed Éléments de 5000 à 6000 pb:

25 Séquences moyennement répétées
 Séquences à fonction connue : - code pour produits de la transcription : ARN ribosomiaux ou de transfert - code pour protéines histones

26 Séquences très répétées Séquences moyennement répétées
Séquences uniques  Familles multigéniques : gènes différents mais qui donnent des polypeptides très proches (qui exercent fonction voisines au cours de la vie cellulaire mais pas au même moment Ex : gènes de globine, d'actine (10 à 20 gènes), de myosine, de tubuline, de kératine  Théorie brownienne ("aléatoire" ou "statistique") de génétique : un gène a d'autant plus de chance d'être transcrit qu'il est proche d'une gène transcrit

27 Moins de 100kb

28 Plus de 100kb

29 a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées
b) Un génome morcelé - Mise en évidence d'une maturation des ARNm chez les eucaryotes exp. ARNm d'ovalbumine chez cellules oviducte de poule cf epissage des introns au niveau des pores nucléaires  épissage alternatif. Notion de transcriptome : démultiplication des transcrits (par épissage alternatif) transcrits différents pour gènes (pas tous exprimés dans un type cellulaire donné)

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31 Modélisation de l'intervention des SNURP U1 à U6 dans l'épissage des introns

32 - Notion de génome (à distinguer d'ADN nucléaire) : ensemble des gènes.
Rappels : - ADN satellite = hétérochromatine : 10% de l'ADN nucléaire; - ADN répété dispersé : 20% de l'ADN nucléaire - ADN parfois considéré comme "poubelle" : plus de 50% de l'ADN nucléaire mais jouant le rôle d'espaceurs (vision statistique du transcriptome) - ADN transcrit en ARNprém = génome ( gènes chez l'Homme) : 5 à 7 % de l'ADN nucléaire  Environ 40% seulement des gènes du génome sont transcrits dans un type cellulaire soit 2 à 3% de l'ADN nucléaire

33 a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées
b) Un génome morcelé c) De l'ADN associé à des protéines : la chromatine Définition simplifiée de la chromatine - Forme sous laquelle l'ADN nucléaire est associé aux protéines histones. NB : ADN absolument nu n'existe pas, ni chez les Procaryotes (pseudohistones et/ou autres protéines acides) ni chez les Eucaryotes, ni chez les acaryotes (Virus : prot SSB sur ADN simple brin, par ex.).

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35 Caractérisation de la chromatine
Méthode d'étude de la chromatine - Caractérisation difficile de l'état natif de la chromatine : isoler + purifier - Chromatine insoluble dans les tampons physiologiques - Quand [sels]  : dissociation des protéines dénude l'ADN  visqueux (brin long) - Nécessité de couper physiquement l'ADN : ultrasonication (on ne sait pas trop ce qu'on a perdu…)

36 Composition de la chromatine
ADN purifié = 30% (en masse) Protéines histones : 40 % Type PM ( D) Nb d'aa Rapport Lys/Arg H aa 10 : prot très basique H2a aa 1,2 H2b aa 2,5 H aa 0,7 H aa 0,8  Toutes sont basiques Pas spécifiques de l'espèce (2 aa différents entre pois et souris)

37 Protéines non histones : 25 %
- Toutes sont neutres ou acides - 300 types différents - Imparfaitement connues - Rôles (?) : structural (charpente, centre organisateur du nucléole, des kinétochores, du centrosome , des extrémités télomériques…)? Transcription? Maturation des ARN?

38 ARN : 5 % - rôle fonctionnel - rôle structural ? Ex : Implication dans la formation de HC Cas de l'HC centromérique : caractérisée par forte concentration d'histone H3 méthylée et de protéines HP1 hétérochromatiques de structure Après incubation avec de la RNAse A  délocalisation des HP1

39 a) Des séquences d'ADN plus ou moins répétées
b) Un génome morcelé c) De l'ADN associé à des protéines : la chromatine d) Les différents états de la chromatine : nucleofilament  condensé - décondensée pendant interphase - condensée pendant mitose : K métaphasique (assure réplication conforme et protection mécanique au cours de la ségrégation des lots de gènes)

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41 Filament de chromatine X 125 000

42  Mise en évidence de l'organisation en nucléosomes du nucléofilament
d1) Structure décondensée de la chromatine : le nucléofilament (fibre nucléosomique) = une molécule d'ADN associée à des protéines histones basiques  Mise en évidence de l'organisation en nucléosomes du nucléofilament Filament de chromatine X marqué au tétroxyde d'osmium OsO4

43 - microscope électroniqueME : chaînes de particules accolées de  11nm (27 à 30 nm fonction de la présence ou non de H1. [NaCl]<0,3M - Spectre de diffraction aux RX : période 100Å (10 nm) (≠ périodicité de l'ADN ou des histones) - Réalité fonctionnelle : toutes les endonucléases (foie de rat, staphylocoque...) coupent le nucléofilament environ toutes les 200 pb (du à propriété du nucléofilament et non des endonucléases) - Étude des associations ADN/histones par pontage chimique

44 Conséquences physiologiques : lors de la réplication, l'ADN s'ouvre tous les 200pb

45  Association des histones
Acétylations des histones néosynthétisées H4 sur les lysines K5/K12 Assemblage des histones : par liaisons faibles type Van der Waals tétramère (H3-H4) d'histones nouvellement synthétisées + 2 dimères H2A-H2B  formation de la particule nucléosomale cœur (core particule) Maturation (consomme ATP)  espacement régulier des nucléosomes  désacétylation des histones nouvellement incorporées Incorporation des histones H1 internucléosomales  repliement du nucléofilament

46 L'ADNase 1 relâche les liens : les noyaux s'éloignent = on obtient un nucléofilament
Ici : digestion  poussée à la DNase micrococcale

47 d2) Hétérochromatine condensée et méthylation de l'ADN
 Hétérochromatine constitutive ou facultative

48 L'HC facultative est réversible : méthylée sur Lysine K9, hypoacétylées, répliquée tardivement, fct du stade de développement ou du type cellulaire. Ex1 : X inactif (Corps de Barr) dans les cellules somatiques femelles Ex2 : vésicule sexuelle (VS) inactive au stade pachytène de la méiose masculine (mutation provoque stérilité)

49 La position de certains gènes à proximités d'HC facultative peu gêner leur transcription (régulation) L'HC constitutive n'est pas réversible Ex1 : HC centromérique = assure cohésion des chromatides sœurs et disjonction des chromosomes mitotiques

50 métyltransférase DNAmétyltransférase Heterochromatine Protein 1

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52 d3) Niveaux supérieurs de surenroulement de la chromatine
 Association du nucléofilmanent à des protéines non histones séquences SAR répétées riches en A/T positionnées jamais à l'intérieur du gène

53 Chez l'Homme : longueur totale de l'ADN déroulé  2 m
SI Nucléofilament SII Fibre chromosomique (6 nucléosomes par tour)  20 cm Microconvules Spires (conrrespondant aux bandes de coloration) SIII Chromosome métaphasique

54  Mee de Taylor : relation ADN/chromosome métaphasique

55  Structure schématique d'un chromosome métaphasique

56  Evolution du degré de compaction au cours d'un cycle cellulaire

57 Interprétation physiologique de la compaction (cf § support cellulaire de l'IG) :
Nucléofilament : - en G0, G1 et G2 : protection contre les endonucléases - en phase S : unité de réplication K métaphasique mitotique : protection mécanique lors de la disjonction des chromatides des chromosomes (à l'anaphase)

58 B. Organisation fonctionnelle des génomes
1- Le génome bactérien circulaire 2- Le génome eucaryote linéaire 3- Le génome viral : compacté

59 a) HISTORIQUE : - étymologie : "poison" en latin - fin du XIX Première définition = êtres vivants provoquant des lésions, passant à travers des filtres de porcelaine (contagion encore possible ex Mosaïque du tabac 1898; Pasteur et virus de la rage) « virion » introduit par André Lwoff = particules virales (les distinguer de leurs effets pathologiques) -Taille <1µm Ex TMV = 300 nm Essor de la biologie moléculaire, étude du cycle viral, découverte des oncogènes viraux début des années 1980 : apparition du SIDA (syndrome d’immunodéficience acquise) et découverte du VIH (virus de l’immunodéficience humaine J. C. Chermann, F. Barré-Sinoussi, F. Rey, L. Montagnier, 1983 et 1984)

60 b) DEFINITION (d'après Lwoff)
1– Virion : un acide nucléique et des protéines en une structure définie et constante, qui possède des éléments de symétrie (ni cytoplasme ni noyau) 2– Un seul type d’acide nucléique, ADN ou ARN, jamais les deux. 3– Incapable de croître en taille ou de se diviser de manière autonome. 4– Un parasite absolu de la cellule : possède l’information nécessaire à la synthèse de ses propres constituants, mais n’a pas les moyens d’exprimer cette information (système de transcription de l’ADN en ARN messager et de traduction des messagers en protéines).

61 Agents infectieux exclus de la catégorie des virus
- Les viroïdes = simples boucles d’ARN ( 300 nucléotides) infectent certains végétaux mais ne codent aucune protéine; pathogénicité serait liée à interactions avec mécanismes cellulaires de synthèse protéique (maturation des ARNm) - Les prions : protéines capables de provoquer, après une longue période d’incubation, des maladies neurodégénératives chez les Mammifères (tremblante du mouton, maladie de la vache folle ou maladie de Creutzfeldt-Jacob chez l’Homme). Appartiendrait à une famille de protéines « chaperonnes » Forme mutée, transmissible, pathogène.

62 c) CONSTITUTION DES VIRUS : nucléocapside éventuellement enveloppée
- forme de la nucléocapside : pseudosphérique, hélicoidale, icosaédrique (cas des phages) - enveloppe éventuelle et spécificité antigénique : cas de VIH - gp120 porté par gp 41 membranaire, - gp sous membranaire - gp de nucleocapside et - protéine p6, p7 protégeant les deux ARN

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64 Un seul type d'acide nucléique
Virus à ADN - Exemples : Phage lambda, virus de l’hépatite B (5 kilobases, le plus petit connu), herpès virus (100 kilobases), etc. - Taille : 1,5 à 50 103 kb - La molécule peut être  un double brin (Phages lambda; varicelle, zona, mononucléose, variole)  un simple brin (Parvovirus des erythèmes infectiaux) directement codant (simple brin positif),  un simple brin complémentaire du brin codant (simple brin négatif)

65 Lyse bactérienne phagique

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67 Nucléocapside formée de
Protéines de la capsides au niveau de la tête gaine caudale fibre épines du plateau

68 L= 300 nm  =18 nm ouverture centrale = 4 nm Hélice droite 2130 sous unités protéiques (17,5 kD) ARN simple brin + Chaque sous unité protéique recouvre 3 nucléotides

69 Un seul type d'acide nucléique Virus à ARN
- Monocaténaire "+" : directement codant pour des protéines Ex : TMV, Poliomyélite, rhume, hépatite A, rubéole) - Monocaténaire "-" : qui devra être complémenté en ARN"+" avant de coder pour protéine Ex : Rage, encéphalite, rougeole, oreillons, grippe) - Bicaténaire : Diarrhée - Rétrovirus : brin d'ARN réverse-transcrit en ADN par réverse-transcriptase (= transcriptase inverse) ADN pouvant s'intégrer dans le génôme de la cellule hôte par ses Long Terminal Repeat (LTR  circularisation) Ex : VIH

70 Cartographie du phage T1
d) ORGANISATION du génome viral Cas du Phage l Groupes fonctionnels 1. Tête 2. Plateau 3. Cou et collier 4. Plateau 5. Métabolisme des Nucleotides 6. Fibres 7. Membrane 8. Enzymes DNA Cartographie du phage T1

71 Cas du TMV (Tabacco Mosaïc Virus)

72 Cas du VIH (Virus de l'Immunodefiscience acquise Humaine)
2 molécules d’ARN simple brin identiques un exemplaire du génome pouvant muter quand l’autre exemplaire reste stable

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74 A. Support moléculaire de l'IG
B. Organisation fonctionnelle des génomes C. Support cellulaire de l'information génétique cf TP MITOSE - Chez les eucaryotes, dans le noyau, chromosomes plus ou moins condensés suivant les étapes du cycle cellulaire (mitose ou interphase) - Mise en évidence : courbe d'action mutagène superposée à courbe d'absorption des UV par l'ADN