Imagerie moléculaire optique de fluorescence

Présentation au sujet: "Imagerie moléculaire optique de fluorescence"— Transcription de la présentation:

1 Imagerie moléculaire optique de fluorescence
Jean-Marc Dinten CEA-LETI/DTBS

2 Plan Pourquoi l’imagerie optique moléculaire de fluorescence
pre-clinique Clinique Son positionnement par rapport aux méthodes d’imagerie Marqueurs fluorescents Systèmes d’Imagerie de Fluorescence Exemples d’applications : Imagerie per-opératoire Tomographie optique de fluorescence Aide au dépistage du cancer de la prostate

3 Principe et objectifs - To detect - To localize - To quantify label
biomarker antibody peptides Saccharides… Targeted cell label Receptor Probe, Contrast agent Organic dyes Nano-particles Activable probes… - To detect - To localize - To quantify

4 Préclinique : Analyse biologique in situ
Visualiser, les processus biologiques en jeux au niveau cellulaire. suivre pas à pas un médicament pour évaluer ses effets dans le corps d'un animal, mettre en évidence l'expression d'un gène responsable d'une tumeur cancéreuse, localiser des cellules tumorales… permettre la mise au point des traitements ciblés et personnalisés…

5 Etude pre-clinique longitudinale
Suivre le développement d’un modèle de pathologie (ex.: cancer du sein, …..) Développement de médicament Analyser l’effet d’une thérapie

6 Per-op :marquer les tissus d’intérêt

7 Why do we address intra-operative imaging
The surgeon is only guided by: pre surgery imaging eyesight and the sense of touch There is a strong requirement for in situ diagnosis. “Functional and Molecular information”

8 Per-opératoire : ressection tissus cancéreux
Bouclage ressection/anapathologiste  long, risque de marges avec cellules cancéreuses

9 Diagnostic : cas des biopsies de prostate
Statistics: Most frequent type of cancer for men Second cause of mortality by cancer in developed countries One 50 years old man out of 10 will have this cancer. Risk of mortality by this type of cancer 3% Current diagnostic Protocol Routine tests (50 years old men): Digital rectal examination Dosage of PSA (Prostate Specific Antigen) rate in blood If results are positive: Biopsy guided by a transrectal ultrasound probe (TRUS)

10 Difficulté de localiser les tumeurs précoces
Ultrasound lacks contrast to localize early stage tumors and differentiate benign/malignant tumors Biopsy are performed randomly 10 to 12 biopsies/exam, 1 to 3 exams Risk of false negative Risk of dissemination Complications (hematuria, rectal bleeding, vasovagal episode,…)

11 Comment l’améliorer MRI imaging before ultrasound guided biopsy :
improves efficiency of biopsies requires access to MRI and coregistration (MRI/US) provides false positive Elastography Molecular Imaging : PET Fluorescence Imaging

12 Positionnement de l’imagerie de fluorescence

13 The main imaging methods

14 Les systèmes d’imagerie et leur caractéristiques

15 Available intra-operative imaging techniques

16 Available intra-operative imaging techniques

17 Need for another modality
The existing intra operative imaging techniques require: heavy and expensive instrumentation, dedicated operating room and contribution of skilled operators The new imaging techniques should: be affordable for most of the hospitals not require dedicated infrastructure, not require a specific skill to be used give access to molecular and functional information, give a direct access to this information (no specific skill to provide the diagnosis) should be completely integrated in the operating room workflow.

18 Sensibilité des approches
Les biomarqueurs sont en général en concentration relativement faible. Si on prend une image en microscopie de fluorescence (limite de détection de l’ordre de 10 protéines fluorescentes) on marque avec en gros de qq molécules par cellules à qq 104 molecules par cellules

19 Sensibilité des approches
105 marqueurs par cellules ciblée. Si on est sensible au femtomole (PET ou Fluorescence), on est capable de détecter 6, molécules de marqueurs, soit 6, cellules (une cellule ~ mm3). Ce qui correspond grosso-modo une sphère de 0,2mm de diamètre. Si quelques fluorophores par cellules et la même sensibilité : on détecte à partir d’une sphère de 10mm de diamètre. Attention: La quantité de marqueur impliqué dépend du phénomène observé. On n’est pas dans le cas d’un produit de contraste ou le signal dépend de la concentration du produit de contraste. Si on veut augmenter la sensibilité, il faut amplifier!!!

20 Sensibilité des approches
Supposons qu’on utilise une solution de marqueur concentrée à 1µM/l et qu’on veuille détecter cette solution directement Méthode de mesure Sensibilité Volume de molécule marquée dans une solution au µM/l Bioluminescence f.molaire 10-3mm3 Fluorescence 2D en surface PET SPECT p.molaire 1.mm3 IRM n.molaire 1.cm3 (en fait on utilise des solution plus concentrées, 0,5mmol/ml, 500mol/l) Rayons X µ.molaire 1.dm3(en fait on utilise des solution plus concentrées 1mol/ml, 1000mol/l) Ultrasons ?

21 Sensibilité des approches
Les US et les X ne sont pas adaptés à l’imagerie moléculaire. L’IRM est encore trop peu sensible, mais des techniques d’amplification de signal en cours de développement font progresser les choses. Aujourd’hui les X, US et IRM sont mieux placées sur des « surrogates » marqueurs de type physiologiques. (qui peuvent être imagés avec des produits de contraste). Aujourd’hui le principal outil en clinique pour l’imagerie moléculaire c’est le PET. En précliniques les outils de référence sont: la bioluminescence, le PET, le SPECT et la fluorescence.

22 Why should we use fluorescence
Reference technique in microscopy to visualize biological pathways A lot of probe have already been designed Non radioactive Low cost Not in the scope of the 3 majors of molecular imaging

23 Marqueurs fluorescents

24 Les principaux type de processus biologiques visés
Expression d’un gène, activité d’un promoteur Interaction entre cellules Interaction entre protéines Mesure d’activité enzymatique Surexpression d’une protéine particulière

25 Types de marquages (avantages et inconvénient)
PET Produit radioactif durée de vie relativement courte 2h pour le 18F. Fortes contraintes sur la pharmacocinétique du produit, il faut développer une chimie rapide. Le marqueur émet tout le temps (on ne peut pas facilement faire la différence entre signal spécifique et non spécifique) On peut réaliser des molécules très proches des molécules naturelles SPECT Produit radioactif, durée de vie de 6h pour le 99mTc. Fortes contraintes sur la pharmacocinétique du produit, il faut développer une chimie rapide (un peu plus simple que la chimie du PET. IRM On utilise des marqueurs qui modifient les caractéristiques paramagnétiques du milieu (Gd, particules ferromagnétiques). Effets secondaires. Quantités élevées injectées... Bioluminescence Résevé aux applications précliniques. permet de voir sur des épaisseurs de l’ordre du cm, l’expression de gènes. Fluorescence Pour les protéines fluorescentes de type GFP, c’est réservé aux applications précliniques. Pour les marqueurs extrinsèques, on arrive a construire de très petites molécules qui vont cibler précisément (on se rapproche des caractéristiques du PET. On peut utiliser des phénomènes de FRET pour activer… Pb on est limité à de très faibles profondeurs (à 1cm de profondeur la sensibilité est de qq 100pmolaire.)

26 Structure d’un marqueur pour l’imagerie moléculaire

27 Tailles et poids Dalton (D) = 1.6710-24 gramme
Cellule: 10µm donc un volume de −9 cm3. Si on suppose une densité de 1.03 g/ml, la cellule a un poids de −9 g cad D = kD Bactérie 1µm Virus ~ 100 nm Nanoparticule de 4 à 100nm (1.9 nm gold core, ~50,000 Da.). Anticorps dimmension de l’ordre de 100 Angstrom (150kD) Antigene peut être très petit (juste l’épitope qui est reconnu par l’anticorps) qq10 KD Fluorophore (GFP: 26kD) Fluorophores organiques type cyanines ( kD)

28 Tailles et poids

29 Les marqueurs cliniques
La toxicité / le marché Validation (end point) difficile a vérifier et très longue. Pour du criblage il faut être certain qu’il n’y a aucune toxicité Pour du diagnostique il faut un marqueur qui soit générique. Monitoring/imagerie préclinique/imagerie clinique.

30 Les marqueurs Moleculaires cliniques
Les principales approches Sucre, anticorps ou petites molécules marquées avec du 18F ou du 99mTC Aucun traceur fluorescent pour l’imagerie moléculaire n’est encore sur le marché. Quelques uns sont en phase d’essai clinique Pour le clinique on en est encore à la préhistoire de l’imagerie moléculaire. le galacto cRGD (arginine, glycine, acide aspartique)

31 Les marqueurs précliniques
Le pouvoir est à l’imagination !!! Pas de contraintes fortes au niveau de la toxicité. Pas de contraintes de marché. Ce qu’on veut voir c’est le mécanisme biologique. C’est là qu’on devrait trouver les marqueurs cliniques de demain

32 Les marqueurs précliniques
Marqueurs endogènes (générés par l’animal) Bioluminescence Protéines fluorescentes Marqueurs exogène (on les injecte) Passif Ciblée Activable L’amplification du signal in vivo : c’est le prochain défi de l’imagerie moléculaire.

33 MARQUEUR FLUORESCENT ACTIVABLE

34 Les grandes familles de marqueurs
Ligands Anticorps/Antigènes Petites molécules Peptides Sucres

35 Les grandes familles de marqueurs
Cargo Nano particules Structures peptidiques

36 Les grandes familles de marqueurs
Label Souvent les nanoparticules servent de cargo et de label simultanément Les molécules radioactives 99mTc et le 18F souvent encapsulées dans des chélates. Les fluorophores organiques Nanoparticules: dans les précédentes celles qui peuvent émettre un signal

37 Systèmes d’imagerie moléculaire de fluorescence

38 L' imagerie optique diffuse de fluorescence
Marquage des tumeurs ou de la circulation sanguine par une molécule fluorescente et détection du signal fluorescent. filtres excitation nm détecteur émission nm Détection, localisation et quantification de la cible.

39 Voir la lumière au travers des tissus biologiques
Problème 1: Forte absorption de la lumière par les tissus biologiques Strong heamoglobin attenuation Strong water attenuation As mentioned in previous presentations, biological tissues strongly absorb light. So the first difficulty is to imagine a system that produces a good enough signal-to-noise ratio. Here you have the general graph presenting the absorption profile of the common chromophores. In the visible wavelength range, the main absorber is the blood until 600 nm and in the IR, the water starts to absorb. Nevertheless, between, let say 600 nm and 1 micron, from red to NIR, you can find the minimum of absorption of the tissues. This is illustrated by this picture: when lighten a biological tissue with white light, the radiation that comes out is red. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission doivent être dans le rouge / proche infra rouge

40 Voir la lumière au travers des tissus biologiques
Problème 2: Diffusion de la lumière La lumière ne se propage pas en ligne droite… Les photons sont diffusés par des structures dont la taille est de l'ordre de celle de la longueur d'onde de la lumière (diffusion de Mie) µs>>µa Source de lumière Modèle de propagation de la lumière dans les tissus : équation de diffusion So, according to the technology, you can see light through the tissues, but this is not enough to make a picture. Indeed, unlike X-Ray, red and NIR like does not propagate in straight line. If you lighten a biological tissue with a collimated beam of radiation of interest, what you collect is a signal totally distorted. This signal is distorted because of the presence of inhomogeneities like mitochondria, whose size is comparable to the radiation wavelength. In this graph is represented as examples the scattering coefficient of several classical tissues (breast, forearm, and intralipid 1% often used as phantoms of biological tissues), as a function of the wavelength of interest. A scattering coefficient of 10 cm-1 basically means that in 1 cm the radiation has been totally scattered 10 times. In other words, 1mm depth of a tissue with a scattering coefficient of 10 cm-1 is enough to have the radiation totally scattered. Nevertheless, all information about the structures of the medium is content in this distorted signal. And the challenge is to recover these informations. excitation Source Détecteur

41 Modèle de l'imagerie optique de fluorescence
Source Détecteur excitation fluorophore CCD Source Détecteur excitation emission fluorophore b(r) est le facteur de conversion de la lumière d'excitation en un point r en lumière fluorescente. Proportionnel à la concentration de fluorophores

42 Principes de l'imagerie optique de fluorescence
Filtre Filtre Excitation Détecteur Excitation Détecteur Echantillon Echantillon Imagerie de fluorescence par reflexion (FRI) Imagerie de fluorescence par transmission Séparation des signaux d'excitation et d'émission Le signal d'excitation est beaucoup plus important que le signal de fluorescence (au moins 106). Le filtre doit être optimisé pour supprimer le signal d'excitation

43 Imaging issues Constraints: Attenuation Autofluorescence
Non specific signal Light scattering

44 Attenuation Select the wavelength 700-850nm Count all the good photons
Strong heamoglobin attenuation Strong water attenuation Large aperture lenses High sensitivity cameras/Detectors Wavelength/detector sensitivity Long integration time

45 Fluorophore wavelength
Imaging issues Probe characteristics Physical Issues Detector characteristics Fluorophore wavelength 700<a<800 Attenuation Increase sensitivity Autofluorescence

46 Autofluorescence Select a wavelength > 700nm Spectral unmixing
Fluorescence ≠ Autofluorescence Time resolved imaging

47 Decrease autofluorescence
J. Frangioni, Current Op. in Chem. Biol., 2003 Select a wavelength > 700nm !

48 Autofluorescence Select a wavelength > 700nm Spectral unmixing
Fluorescence ≠ Autofluorescence Time resolved imaging

49 Spectral unmixing

50 Autofluorescence Select a wavelength > 700nm Spectral unmixing
Fluorescence ≠ Autofluorescence Time resolved imaging

51 Probe photochemical parameters
Brightness fluorescence time of life Quantum yield < 100 mn Lipid core and fluorophore 100 dies/NP 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Nano-ICG Free ICG Tumour/ Skin ratio 647 nm 666 nm Ф = 0,37 τ = 1,8 ns Ф = 0,29 DiD τ = 1,1 ns

52 Autofluorescence Select a wavelength > 700nm Spectral unmixing
Fluorescence ≠ Autofluorescence Brightness Quantum yield fluorescence time of life Time resolved imaging < 100 mn Lipid core and fluorophore

53 Time resolved imaging Target Nb of photons Autofluorescence
Fluorecence signal Time (ns) Travel time of the photons few ns

54 Autofluorescence Select a wavelength > 700nm Spectral unmixing
Fluorescence ≠ Autofluorescence Brightness Quantum yield fluorescence time of life Time resolved imaging Target < 100 mn Lipid core and fluorophore

55 Imaging issues Probe characteristics Physical Issues
Detector characteristics Fluorophore wavelength 700<a<800 Attenuation Increase sensitivity Brightness Quantum yield Fluorescence time of life Autofluorescence Spectral information Time resolved imaging Non specific signal

56 Non Specific signal Increasing specificity: activatable probes
Classical probe RAFT-(cRGD)4-Cy5 Activatable probe RAFT-(cRGD)4-Cy5-S-S-I Cleavable spacer Inhibitor Enzyme Label

57 Imaging issues Probe characteristics Physical Issues
Detector characteristics Fluorophore wavelength 700<a<800 Attenuation Increase sensitivity Brightness Quantum yield Fluorescence time of life Autofluorescence Spectral information Time resolved imaging Activatable probe Non specific signal Light scattering

58 Light scattering Enlarge the geometry: increase the distance between excitation points and or measurement points. (scan the source) Detector Fluorescence: l = 790nm source: l =690nm

59 Light scattering Enlarge the geometry: increase the distance between excitation points and or measurement points. (scan the source) Detector Fluorescence: l = 790nm source: l =690nm

60 Imaging issues Probe characteristics Physical Issues
Detector characteristics Fluorophore wavelength 700<a<800 Attenuation Increase sensitivity Brightness Quantum yield Fluorescence time of life Autofluorescence Spectral information Time resolved imaging Activatable probe Non specific signal Light scattering Enlarge the geometry (scan the source Tomography)

61 Imagerie moléculaire de fluorescence per-opératoire

62 Visualisation Tissus tumoral Quyen Nguyen, Tsien

63 Visualisation Tissus tumoral sous le muscle

64 Visualisation ganglion sentinelle Quyen Nguyen, Tsien

65

66 Tomorow surgery will be guided by molecular imaging

67 available for animal use: regulatory toxicity study under progess
Products: Imaging instrumentation and probes Fluobeam®700 / Fluobeam®800 Angiostamp®700 /Angisotamp®800 Sentidye®700 /Sentidye®800 Angiostamp® Sentidye® Fluobeam® available for animal use: regulatory toxicity study under progess

68 The reader Fluobeam® 68

69 The reader Fluobeam®

70 Technical issues: Work in ambiant light
Eye sensitivity Quality of the filtering is the key work around 800nm ease the thing

71 Technical issues: Selection of the wavelength
ICG IRDye800-CW Sentidye800 Zw800-1 (Frangioni) …etc. Angiostamp®800 ICG+Albumine ICG+eau Glucosée

72 Fluobeam® technical data:
New features: Low weight (0.7kg) Polypropylene housing Class 1 laser USB2 driven IP67 head IRC>85% CE medical sterile cover Compatibility windowsXP and windows7 Fluobeam®700 Excitation 680nm 60mW/cm2 Emission >700nm FOV: 13.6x10.1 cm Focus distance 17cm Resolution 2 lp/mm Fluobeam®800 Excitation 780nm 100mW/cm2 Emission >830nm FOV: 10x7.5 cm Focus distance 22cm Resolution 2 lp/mm

73 Fluobeam®: limit of detection
Fluorescent probe Fluobeam®700 Fluobeam®800 AngioStamp®800 5 pmoles < 1 pmole ICG eau glucosée 17 pmoles 8 pmoles ICG Albumine 3,4 pmoles Sentidye®800 <1 pmole 0.1 pmole Sentidye®700 AngioStamp®700 2 pmole

74 Un exemple d’application
La fluorescence pour guider la chirurgie des cancers. Les structures sont en surface ou proche de la surface En fluorescence on aura un bon rapport signal/bruit La géométrie est quasi indépendante du patient. Le coût des développements technologiques à réaliser est asez limité. Le point dur reste le traceur (AMM, FDA Agreement)

75 Probe issue Today there is no malecular probe available for intra operative surgery The only NIR fluorescent molecules that can be used are the Methylene blue and the Indocyanine Green (ICG) The clinical intra-operative applications rely today on these two fluorescent probes.

76 Angiostamp®800 cRGD have a high affinity with avb3 integrin, multimeric molecule have a better specificity. About 25% of the cancer cell lines over express the avb3 integrin Detect neo-angiogenesis The level of internalization is higher with multimeric cRGD probes K A P G O N D f R dye a b Extracellular space intracellular space Integrin heterodimer

77 Tumor Detection and Margin Identification

78 Applications : Angiostamp®800
Tumor Healthy tissues Tumors Make the difference between healthy tissues and cancerous tissues

79 Translation to surgery
Suivi du drainage lymphatique

80 Translation to surgery
Ciblage intégrine avb3 Angiostamp®

81 Un autre exemple d’application
La chirurgie vasculaire et cardiovasculaire. Visualiser la perfusion dans une artère après anastomose Contrôler la qualité d’un pontage Vérifier la bonne perfusion d’un lambeau Fournir des paramètres hémodynamiques

82 Vascular Imaging

83 Vascular Imaging Carotide with stenosis (diameter divided by 4.7)
Hemodynamics data computed on fluorescence sequences: distance between ROIs: 12.66mm time shift: 14 frames average speed: 0.045m/sec flow: 96ml/mn Artery diameter: 6.76mm Stenosis diameter: 1.45mm Spasms and accumulation of ICG can be seen upstream of the carotid. The flow is established by burst after the stenosis

84 What can we see : An in situ biological analysis in order to visualize the status of the tissues. Morphological and physiological informations such as the functionality vascular bypass

85 Tomographie optique de fluorescence
IAB IAB Grenoble Intestinal metastasis localization Ovarian peritoneal metastasis Kidneys-bladder (Results by courtesy of Jean-Luc Coll)

86 Fluorescence diffuse optical tomography

87 Principe de la tomographie planaire
100 200 300 400 500 600 50 150 250 350 450 Caméra de haute sensibilité lentille

88 Applications: oncology (breast cancer) 2/2
day 10 day 12 day 14 IAB Grenoble (Results by courtesy of Jean-Luc Coll) fDOT IAB IAB IAB Comparison with FRI Diseased mouse Healthy mice Experiment Day 10 Day 12 Day 14 H1 H2 1st inj H2 2nd inj H3 1st inj H3 2ndinj Fluorescence yield amount 0.071 0.095 0.130 0.035 0.041 0.040 0.033 FRI IAB IAB IAB 88

89 Aide au diagnostic du cancer de la prostate

90 Prostate : a dedicated US/optical probe
Time-resolved detection Bimodal TR probe Dedicated laser The optical head consists of 10 channels of fibers, 6 for excitation light and 4 for fluorescence detection. The minimum source detector separation distance of 10 mm ensures a good compromise between fluorescence intensity collection and background signal reduction. The ultrasound part is based on a planar array of 128 tranducers in “endfinger” setup. Illumination fiber Detection fiber é Ultrasound system US tranducer : 128 points; 6,5 MHz

91 Prostate : 3D fluorescence reconstruction
Reconstructed inclusion Excitation (laser) fiber Detection fiber Bimodal probe Acquisition time 1mn Reconstruction time 1mn Accuracy : 1.5mm Precision : 1mm

92 Prostate : Results Prostate mimicking phantom Preclinical
Central zone Surrounding tissues Rectum Prostate mimicking phantom (Polymer, silice beads, TiO2, ink) Fluorescence yield co-registered in US image Depth 2 cm Resolution 1mm Preclinical phantom probe mouse tumor

93 Merci de votre attention