Etude cytogénétique d'une série de 297 myélomes multiples : expérience du laboratoire de Strasbourg Antoine ITTEL, Claire GEISS Laboratoire de Cytogénétique Hématologique Hôpital Hautepierre, Strasbourg

Electrophorèse des protéines sériques Autrement appelé maladie de Kahler 10 à 15% des pathologies hématologiques comprend un large spectre de formes cliniques : depuis la forme asymptomatique à la forme agressive avec atteintes tissulaires multiples diagnostic basé sur une combinaison de critères : cliniques (douleurs osseuses, infections…) biologiques (immunoglobuline monoclonale 50% IgG, 20% IgA, hypercalcémie, anémie, insuffisance rénale…) radiologiques (lésions osseuses, ostéoporose, fractures…) Survie : médiane à 3-4 ans (de <6 mois à >10 ans) Myélome multiple Présence d’un pic Normal Electrophorèse des protéines sériques D’après OMS 2008

Myélome multiple : définition D’après Rajkumar SV et al. International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma. Lancet Oncol. 2014 Nov;15(12):e538-48

A l’origine du myélome multiple : le plasmocyte Un des critères principaux : l’atteinte médullaire au moins 10% de plasmocytes anomalies morphologiques +/- (+/- anomalie à l’immunophénotypage) Plasmocytes dystrophiques Plasmocytes morphologiquement normaux Normaux : cytoplasme abondant, baso, RNC bas, présence d’un archoplasme (Golgi), noyau excentré, chromatine très motté (carapace de tortue) Dystro : anomalies de taille, augmentation du RNC, anomalies cytoplasmiques (plasmo aspect flammé [rosé] -> IgA, corps de Russell = vacuole cyto), anomalies nucléaires (corps de Dutcher = inclusions intranucléaires volumineuses et translucides, nucléoles, chromatine décondensée)

Marqueur spécifique du plasmocyte : le CD138 étude cytogénétique : difficile : faible capacité proliférative des plasmocytes tumoraux essentielle : certaines altérations cytogénétiques ont un impact majeur sur le pronostic des patients pour améliorer la spécificité et la sensibilité de l’étude cytogénétique, sélection des cellules CD138+ (plasmocytes) CD 138 CD138 : Synonyme : protéoglycanne héparine sulfate, syndécanne-1 Anticorps anti-CD 138

Tri des plasmocytes CD138+ A Strasbourg, test de 2 kits de sélection sur microbilles magnétiques MACS ® Technology, Miltenyi Biotec EasySep™ Human CD138 Positive Selection Kit, Stemcell Technologies D’après http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Files/Navigation/Cell%20Separation/macs-technology-cell-isolation-brochure.ashx

Principe du tri des plasmocytes Autres cellules médullaires Plasmocytes Complexe tétramérique anti CD138/anti dextran Billes magnétiques

Expérience du laboratoire de Strasbourg Etude rétrospective monocentrique d’une série de 297 patients ayant eu un prélèvement médullaire pour myélome Prélèvement de moelle pour suspicion de Myélome Ponction médullaire Richesse cellulaire ≥ 20.106 cellules au total < 20.106 cellules au total Plasmocytes dystrophiques ≥ 5% Plasmocytes dystrophiques < 5% Cytologie médullaire Tri CD138 sur billes magnétiques Tri cellulaire Culture de 72h des CD138+ non stimulée Culture de 72h non stimulée Mise en culture FISH TP53 et t(4;14) Caryotype Etude cytogénétique Caryotype si présence de métaphases en FISH FISH TP53 et t(4;14) (si >10% de plasmocytes)

Résultats Sans tri Avec tri CD138 Total Nombre de patients 139 158 297 Caryotype anormal 35 (25%) 40 (25%) 75 (25%) Caryotype normal 93 (67%) 11 (7%) 104 (35%) Echec du caryotype 11 (8%) 107 (68%) 118 (40%) Un caryotype de myélome sur 4 est anormal avec ou sans tri (72% d’entres eux sont complexe) Le tri n’a pas permis d’augmenter le nombre de caryotypes anormaux Sans tri : peu d’échec du caryotype mais une majorité normale les métaphases analysées en l’absence de tri ne sont souvent pas des plasmocytes !! Avec tri : 68% d’échec de caryotype (de culture) et peu de caryotypes normaux le caryotype après tri est bien le reflet de la prolifération plasmocytaire

Résultats Mise en évidence d’une anomalie (caryotype et FISH) dans : Sans tri Avec tri CD138 Total Nombre de patients 139 158 297 - Délétion du gène TP53 11 22 (7,4%) - t(4;14) IGH-FGFR3 10 16 26 (8,7%) - t(11;14) IGH-CCND1 8 12 20 (6,7%) - t(14;16) IGH-MAF 2 4 (1,3%) - IGH autre 20 28 (9,4%) - Hyper diploïdie 13 15 - Hypo diploïdie 17 33 (11,1%) - Gain 1q 5 10 (3,4%) - Caryotype complexe 27 26 53 (18%) Mise en évidence d’une anomalie (caryotype et FISH) dans : 63% des analyses avec tri 41% des analyses sans tri 41 patients (14% ; 19 tris et 22 sans tri) : matériel insuffisant pour une étude en FISH quand plasmocytose <40%, le tri permet d’augmenter le pourcentage d’anomalie (caryotype et/ou FISH) de 26% à 58% aneuploïdies et caryotype complexes sous estimés ; ne sont mises en évidence que au caryotype rarement ciblés par les sondes de FISH utilisées en routine

Les anomalies en cytogénétique conventionnelle Sans tri Avec tri CD138 Total - Hypo diploïdie 16 17 33 (11,1%) - Gain 1q 5 10 (3,4%) 41,X,-X,der(6)t(6;13)(q16;q12),i(7)(q10),der(12;18)(q10;q10),-13,-13,der(16)t(1;16)(q22;q12),add(19)(?q13),-21 Caryotype hypodiploïde avec gain 1q Pronostic péjoratif

Les anomalies en cytogénétique conventionnelle Sans tri Avec tri CD138 Total - Hyper diploïdie 13 15 28 (9,4%) 55,X,+3,+5,+6,+7,+9,+11,+15,+17,+18,+19 Caryotype hyperdiploïde

Les anomalies en cytogénétique conventionnelle Sans tri Avec tri CD138 Total - t(11;14) IGH-CCND1 8 12 20 (6,7%) - t(14;16) IGH-MAF 2 4 (1,3%) translocation t(14;16)(q32;q23) IGH-MAF translocation t(11;14)(q13;q32) IGH-CCND1

Les anomalies en cytogénétique Moléculaire Translocation t(4;14)(p16;q32) : fusion IGH/FGFR3 Sans tri Avec tri CD138 Total - t(4;14) IGH-FGFR3 10 16 26 (8,7%) 14 der(4)t(4;14) Pronostic péjoratif der(14)t(4;14) 4 XL t(4;14) Translocation – Dual Fusion Probe (Metasystems®)

Les anomalies en cytogénétique Moléculaire Délétions 17p / perte de TP53 Sans tri Avec tri CD138 Total - Délétion du gène TP53 11 22 (7,4%) add(17)(p11) 17 Pronostic péjoratif XL P53 Deletion Probe (Metasystems®)

Les anomalies en cytogénétique Moléculaire der(16)t(14;16) translocation t(14;16)(q32;q23) der(14)t(14;16) 14 16 Pronostic péjoratif Fusion IGH/MAF XL t(14;16) Translocation – Dual Fusion Probe (Metasystems®)

Conclusion Etude cytogénétique des plasmocytes essentielle car impact pronostique ++ Avantages du tri : caryotype : beaucoup d’échec mais reflet de la pousse plasmocytaire FISH : enrichissement en plasmocytes donc meilleure spécificité et sensibilité Globalement, plus d’anomalies mises en évidence Pour des raisons techniques, tri impossible si prélèvement pauvre et/ou peu de plasmocytes (intérêt de la culture ?) Recommandations du GFCH : t(4;14), TP53, voire (2016 ?) +/- sonde 1p (perte) et 1q (gain) Utilisation de nouvelles sondes de FISH pour cibler les anomalies de mauvais pronostic

Remerciements A l’ensemble de l’équipe du laboratoire de cytogénétique hématologique Dr Carine GERVAIS Eric, Catherine, Odile, Catherine, Xavier, Catherine, Fadoua, Cathy, Claudine, Magali A l’ensemble de l’équipe du laboratoire d’hématologie En particulier Dr Laurie MONIER, Dr Caroline MAYEUR-ROUSSE, Dr Anne-Cécile GALOISY Au Dr Isabelle JAHN du laboratoire d’immunologie