TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE APPLICATIONS CLINIQUES PRINCIPE APPLICATIONS CLINIQUES Nice, Jeudi 19 Novembre B.Quilichini

TECHNIQUE FISH interphasique et métaphasique PLAN HISTORIQUE INTRODUCTION PRINCIPE TECHNIQUE FISH interphasique et métaphasique TECHNIQUE CGH conventionnelle et array APPLICATIONS CLINIQUES

HISTORIQUE

HISTORIQUE (1/1) Années 70 Années 80/ 90 / 2000… Domaine de la Routine Hospitalière ET de la Recherche Sonde d’ADN marquée par modification chimique/physique : rapide : 48 heures  efficacité « Nouvelles techniques » de cytogénétique moléculaire: Multiplex FISH, mBand FISH CGH conventionnelle CGH array Domaine de la Recherche… (1969- Gall et Pardue) Sonde d’ADN marquée par un radio-isotope :  longueur de l’analyse  précaution d’utilisation

INTRODUCTION

INTRODUCTION (1/2)  FISH  CGH  PCR

INTRODUCTION (2/2) Caryotype = Examen de 1ère intention Limites de la cytogénétique conventionnelle: obtention de métaphases résolution : 1 bande = 1500 kb Intérêt de la Cytogénétique Moléculaire….

PRINCIPE

PRINCIPE (1/11) Le principe de la technique d’hybridation in situ en fluorescence avec des sondes froides (FISH) est basé sur le fait que l’ADN est une molécule double hélice formée de deux brins complémentaires.

PRINCIPE (2/11) Le principe de la technique d’hybridation in situ en fluorescence avec des sondes froides (FISH) est basé sur le fait que l’ADN est une molécule double hélice formée de deux brins complémentaires. Ces deux brins peuvent être séparés par la chaleur et / ou par un traitement acide ou alcalin I = ETAPE DE DENATURATION Une sonde d’acide nucléique contenant une séquence complémentaire au simple brin d’ADN, peut alors former un hybride spécifique avec l’ADN simple brin II = ETAPE D’HYBRIDATION Cette sonde est marquée directement ou indirectement avec un ou plusieurs fluorochromes, l’hybridation des séquences nucléiques complémentaires peut être visualisée en fluorescence après contre coloration du support (chromosomes ou noyaux) III = ETAPE DE REVELATION

PRINCIPE (3/11) Ces deux brins peuvent être séparés par la chaleur et / ou par un traitement acide ou alcalin = ETAPE DE DENATURATION Une sonde d’acide nucléique contenant une séquence complémentaire au simple brin d’ADN, peut alors former un hybride spécifique avec l’ADN simple brin = ETAPE D’HYBRIDATION Cette sonde est marquée directement ou indirectement avec un ou plusieurs fluorochromes, l’hybridation des séquences nucléiques complémentaires peut être visualisée en fluorescence après contre coloration du support (chromosomes ou noyaux) = ETAPE DE REVELATION

Sondes spécifiques d’un gène (FISH) ou d’un chromosome (M-FISH) PRINCIPE (4/11) ETAPE DE DENATURATION DENATURATION de la CIBLE DENATURATION de la SONDE * * * * Sondes spécifiques d’un gène (FISH) ou d’un chromosome (M-FISH) préparation Métaphasique = chromosome DENATURATION 70 à 85°C 1 à 5 minutes préparation Interphasique = noyau * *

LECTURE AU MICROSCOPE A FLUORESCENCE PRINCIPE (5/11) ETAPE d’HYBRIDATION c * 37°C qq heures à 3 jours * * * LAVAGE ET REVELATION LECTURE AU MICROSCOPE A FLUORESCENCE

(métaphases pangénomiques) PRINCIPE (6/11) APPROCHE CIBLEE APPROCHE GLOBALE FISH Interphasique (Nx interphasiques) CGH Conventionnelle (métaphases pangénomiques) Multiplex-FISH et SKY (métaphases - panchromosomique) FISH Métaphasique (métaphases 1 ou 2 chromosomes) CGH array (BAC pangénomiques) mBand FISH (étude du banding d’un chromosome )

(métaphases pangénomiques) PRINCIPE (7/11) - Cible : Chromosomes ou Nx interphasiques Sonde(s) d’acide nucléique complémentaire(s) d’une séquence donnée Cible : Chromosomes de référence (CGH conventionnelle) ou BACS (CGH array) 2 Sondes : ADN génomique total de référence et ADN génomique total à tester marqués différemment FISH Interphasique (Nx interphasiques) CGH Conventionnelle (métaphases pangénomiques) Multiplex-FISH et SKY (métaphases - panchromosomique) FISH Métaphasique (métaphases 1 ou 2 chromosomes) CGH array (BAC pangénomiques) mBand FISH (étude du banding d’un chromosome )

PRINCIPE (8/11) FISH Interphasique Multiplex-FISH et SKY FISH - Cible : Chromosomes ou Nx interphasiques Sonde(s) d’acide nucléique complémentaire(s) d’une séquence donnée FISH Interphasique (Nx interphasiques) Multiplex-FISH et SKY (métaphases - panchromosomique) FISH Métaphasique (métaphases 1 ou 2 chromosomes) mBand FISH (étude du banding d’un chromosome )

PRINCIPE (9/11) FISH Interphasique Multiplex-FISH et SKY FISH - Cible : Chromosomes ou Nx interphasiques Sonde(s) d’acide nucléique complémentaire(s) d’une séquence donnée Analyse d’un grand nombre de cellules en évitant l’étape de culture (aneuploïdies?) Remaniements géniques acquis? Clone acquis minoritaire anormal? FISH Interphasique (Nx interphasiques) Analyse d’un caryotype complexe Résultat rendu sur chromosomes Multiplex-FISH et SKY (métaphases - panchromosomique)  Résultat rendu en % de noyaux FISH Métaphasique (métaphases 1 ou 2 chromosomes) Microdélétions ? Anomalies de structure ? Identification de marqueurs ? mBand FISH (étude du banding d’un chromosome ) Anomalie de structure d’1 chromosome Résultat rendu sur chromosomes Résultat rendu sur chromosomes

(métaphases pangénomiques) PRINCIPE (10/11) CGH : hybridation génomique comparative Cible : Chromosomes de référence (CGH conventionnelle) ou BACS (CGH array) 2 Sondes : ADN génomique total de référence et ADN génomique total à tester marqués différemment CGH Conventionnelle (métaphases pangénomiques) CGH array (BAC pangénomiques)

(métaphases pangénomiques) PRINCIPE (11/11) Cible : Chromosomes de référence (CGH conventionnelle) ou BACS (CGH array) 2 Sondes : ADN génomique total de référence et ADN génomique total à tester Marqués différemment Analyse d’un caryotype complexe ou non (anomalies non détectables par technique de cytogénétique classique)  Recherche des déséquilibres Génomiques: GAIN OU PERTE Analyse d’un caryotype complexe ou non (anomalies non détectables par technique de cytogénétique classique)  Recherche des déséquilibres Génomiques GAIN OU PERTE CGH Conventionnelle (métaphases pangénomiques) CGH array PUCES ADN BACs/PACs PUCES ADN OLIGONT

FISH interphasique et métaphasique TECHNIQUE FISH interphasique et métaphasique

TECHNIQUE (1/20) I - Différents types de sondes I 1 - Sondes commerciales : sondes centromériques (séquences répétées) sondes de peinture chromosomique (spécifique d’un chromosome entier ou d’un bras court ou d’un bras long) sondes subtélomériques sondes spécifique d’un locus donné sonde Multiplex FISH/SKY sonde m Band FISH

TECHNIQUE (2/20) 2 sondes spécifiques d’un locus donné sonde centromérique sonde de peinture chromosomique sonde subtélomérique

TECHNIQUE (3/20) Sonde de peinture chromosomique  sonde MUTIPLEX FISH COMBINAISON UNIQUE DE FLUOROCHROMES : SPECIFIQUE D’UNE PAIRE CHROMOSOMIQUE www.metasystem.de

TECHNIQUE (4/20) DEAC FITC Sp Orange Texas Red Cyan 5

TECHNIQUE (5/20) Sonde mBand FISH d’1 chromosome donné COMBINAISON UNIQUE DE FLUOROCHROMES : SPECIFIQUE DU BANDING D’1 CHROMOSOME DONNE www.metasystem.de

TECHNIQUE (6/20) Caryotype spectral

TECHNIQUE (7/20) I - Différents types de sondes I 1 - Sondes commerciales I 2 - Sondes fabriquées à partir d’un ADN recombinant d’intérêt CHOIX du YAC (Yeast Artificial Chromosome), BAC (Bacterial Artificial Chromosome), PAC (Phage Artificial Chromosome) ou Cosmide - EXTRACTION et PURIFICATION - MARQUAGE

TECHNIQUE (8/20) CHOIX Outils de bio-informatique Sites Web / ex : www.genome.ucsc.edu, www.ensembl.org PAC : Phage Artificial Chromosome BAC : Bacterial Artificial Chromosome YAC : Yeast Artificial Chromosome BAC contenant le gène d’intérêt Ex : RP11-121A8 TCR www.genome.ucsc.edu

TECHNIQUE (9/20) PHOTO PHOTO PHOTO NaOH 5’ EXTRACTION – PURIFICATION d’un BAC ISOLEMENT BACTERIEN CULTURE BACTERIENNE EN MILEU LIQUIDE PHOTO PHOTO PRECIPITATION DES MACROMOLECULES ADN D’INTERET EN SUSPENSION NaOH 5’ LYSE BACTERIENNE ALCALINE FILTRATION DU SURNAGEANT et RETENTION ADN d’INTERET sur la résine échangeuse d’anions 50 75 100 150 200 300 400 PRECIPITATION ET LAVAGE de l’ADN D’INTERET Echantillon estimé à 300 ng/µl ESTIMATION QUANTITE de l’ADN D’INTERET extrait ELUTION de l’ADN D’INTERET

TECHNIQUE (10/20) MARQUAGE d’une sonde « froide » : Sonde directement marquée :  incorporation d’un nucléotide directement marqué par un fluorochrome Sonde indirectement marquée :  incorporation d’un haptène (Biotine ou Digoxygénine) à détecter secondairement Technique de Nick-Translation : translation-coupure Technique de Random Priming : marquage par amorçage au hasard Technique de PCR (DOP-PCR ou Alu PCR)

15°C TECHNIQUE (11/20) * * * * * * MARQUAGE par NICK TRANSLATION technique de « coupure-déplacement » 15°C n°1 n°2 n°3 Dnase I 200 et 700 pb : Fragments d’ADN avec la plus grande probabilité de rencontre entre sonde et support dCTP ADN polymérase dATP * dUTP * dGTP * X 174RF DNA * * * Spectrum Orange dTTP

TECHNIQUE (12/20) * dUTP * * * * MARQUAGE par RANDOM PRIMING SEPARATION BRUTALE des 2 brins d’ADN AJOUT d’HEXANt de synthèse et HYBRIDATION au hasard les HEXANt servent d’amorce pour le fragment Klenow de l’ADN polymérase I qui resynthétise le second brin en présence de NT dont un est marqué dATP * dUTP dGTP dCTP Le fragment Klenow est remplacé par l’ADN polymérase du phage T7 * * * *

TECHNIQUE (13/20) MARQUAGE par DOP PCR (degenerate oligonucleotide primer PCR)  pour les sondes de peinture chromosomique Métaphases obtenues après culture Microdissection Isolation ADN Amplification ADN (PCR) en intégrant un Nt marqué « Sonde de peinture »

TECHNIQUE (14/20) II – Préparation du support d’hybridation Différentes cibles : préparation métaphasique (chromosomes) préparation interphasique ( noyaux interphasiques) apposition ou coupe de tissu (tissu congelé – tissu en paraffine) Prétraitement des lames - vieillissement des lames - action d’enzyme à activité lytique (pepsine, RNAse) - déshydratation dans des bains d’éthanol (70% - 90% - 100%) Pour les tissus en paraffine: déparaffinage au xylène et prétraitement spécifique)

1 à 5 minutes selon les protocoles TECHNIQUE (15/20) III – Dénaturation de la sonde et de la cible dénaturation THERMIQUE ET / OU dénaturation CHIMIQUE (formamide) DENATURATION 70 à 85°C 1 à 5 minutes selon les protocoles

TECHNIQUE (16/20) III – Hybridation de la sonde sur sa cible hybridation par complémentarité des bases nucléotidiques 37°C qq heures à 3 jours IV– Lavage - stringence de la solution de lavage température de lavage permet d’éliminer les sondes non spécifiquement fixées (« bruit de fond »)

TECHNIQUE (17/20) V– Détection des sondes DETECTION DIRECTE DETECTION INDIRECTE Sondes marquées par des haptènes (biotine ou digoxigénine) révélés par immunoréaction grâce à des anticorps qui sont couplés à des fluorochromes (directement ou indirectement) = AMPLIFICATION SIGNAL Avantage : - Amplification du signal si le signal est faible Inconvénients : Plus long que la détection directe Difficulté d’obtenir un rapport signal/ bruit satisfaisant avec un minimum de bruit de fond Sondes directement marquées par un fluorochrome Pas d’amplification du signal nécessaire Avantages : RAPIDE SIMPLE Inconvenient : - Pas d’amplification possible si le signal est faible

TECHNIQUE (18/20) + + « sandwich » d’Ac DETECTION INDIRECTE détection des sondes biotinylées : BIOTINE –AVIDINE BIOTINE – Ac ANTI-BIOTINE + fluorochrome (FITC) détection des sondes marquées à la digoxigénine DIGOXIGENINE- Ac ANTI DIGOXIGENINE + fluorochrome (Rhodamine) « sandwich » d’Ac

TECHNIQUE (19/20) VI– Contre-coloration au DAPI/Antifade VII– Analyse au microscope à fluorescence Principe : Absorption d’énergie lumineuse par une molécule (fluorochrome) Passage à l’état de molécule excitée Relaxation partielle avec perte de chaleur par échange avec le milieu ambiant Retour à l’état fondamental par émission lumineuse (de plus grande longueur d’onde que l’onde de stimulation) = spectre de fluorescence

TECHNIQUE (20/20) Les filtres utilisés : Dapi - FITC- Spectrum Orange - Texas Red – DEAC- Cyanine 5 Les filtres sont disponibles avec plusieurs bandes passantes permettant de détecter plusieurs couleurs pendant la même observation Utilisation de caméra numérique / logiciel d’analyse d’image

CGH conventionnelle et array TECHNIQUE CGH conventionnelle et array

CGH conventionnelle Aurias A.

CGH conventionnelle Aurias A.

Caryotype spectral : CGH conventionnelle : - translocation d ’un fragment 7pter sur 17q - t(1;22)(p11;q12) 44, XY, der(1), del(7)(p12-pter), -21, -22 CGH conventionnelle : del(1)(p11-pter) délétion interstitielle 7p del(22)(q12-qter)

CGH array Aurias A.

ANALYSE PANGENOMIQUE: CARYOTYPE – CGH ARRAY ANALYSE CIBLEE: FISH

2- PUCES ADN OLIGONUCLEOTIDES 1- PUCES ADN BACs/PACs - Résolution: 1Mb (puces 3000 clones) - Possibilité de “hot spots” pour étude des régions fréquemment impliquées en pathologie - Possibilité de BACs/PACs contigüs: Tiling Path array (puce 30 000 clones) -> résolution 200kb 2- PUCES ADN OLIGONUCLEOTIDES - Résolution: 20 à 30kb (puces 15000 sondes à 1M de sondes) - Sous catégorie: SNP arrays

C N V

C N V NECESSITE DE DEFINIR: CNV “pathologique” CNV “polymorphique” ?

C N V S N P

C N V S N P AVANTAGE: Diagnostic des Disomies UniParentales +++ Impact Diagnostique +++

APPLICATIONS CLINIQUES

APPLICATIONS CLINIQUES (1/8) - CYTOGENETIQUE CONSTITUTIONNELLE POSTNATALE - CYTOGENETIQUE CONSTITUTIONNELLE PRENATALE CYTOGENETIQUE ACQUISE HEMATOLOGIQUE -CYTOGENETIQUE ACQUISE ONCOLOGIQUE choisir à bon escient l’examen cytogénétique de choix en collaboration avec le cytogénéticien et en collaboration avec le prescripteur…

APPLICATIONS CLINIQUES (2/8) CYTOGENETIQUE CONSTITUTIONNELLE POSTNATALE Caractériser une anomalie chromosomique dépistée sur le caryotype: définir le nombre de chromosomes impliqués dans un réarrangement préciser l’origine d’un chromosome marqueur surnuméraire Rechercher un syndrome microdélétionnel connu après orientation clinique: retard mental syndrome dysmorphique anomalie viscérale (ex: cardiaque) Rechercher une mosaïque syndrome de Turner

APPLICATIONS CLINIQUES (3/8) Caractériser une anomalie chromosomique dépistée sur le caryotype: définir le nombre de chromosomes impliqués dans un réarrangement WCP 3 WCP 3 (der 14)

Caractériser une anomalie chromosomique dépistée sur le caryotype: définir le nombre de chromosomes impliqués dans un réarrangement WCP7 WCP6 t(6;7)

Caractériser une anomalie chromosomique dépistée sur le caryotype: ex: iso(X)(q10)

Caractériser une anomalie chromosomique dépistée sur le caryotype: préciser l’origine d’un chromosome marqueur surnuméraire

chromosome 14 chromosome 22 chromosome 14 chromosome 22 mar ? Caractériser une anomalie chromosomique dépistée sur le caryotype: préciser l’origine d’un chromosome marqueur surnuméraire chromosome 14 chromosome 22 chromosome 14 chromosome 22 mar ?  Sonde locus spécifique du chr 22 ?

APPLICATIONS CLINIQUES (4/8) Rechercher un syndrome microdélétionnel connu après orientation clinique ( syndrome des gènes contigus)

del(4)(p16.3) Wolf-Hirschhorn Tel 1p LSI 1p36 del(1)(pter) Caryotype haute résolution del(2)(qter) Tel 2q LSI WH (4p16.3) délétion 4p16.3 del(4)(p16.3) Wolf-Hirschhorn

del(5)(p15.2) Sd du cri du chat del(7)(q11.2) Sd de Williams LSI Cri du chat (5p15.2) del(7)(q11.2) Sd de Williams LSI Williams (7q11.2) Absence de délétion 7q11.2 délétion 7q11.2

del(15)(q11-q13) ou dup Prader-Willi Angelman LSI Prader-Willi/ Angelman D15S10 ou SNRPN (15q11-q13) Absence de délétion SNRPN délétion SNRPN Attention: en 1ère intention, il est recommandé de réaliser une recherche de SPW ou SA par biologie moléculaire (methyl PCR) et en fonction de ce résultat de réaliser une technique fish afin de déterminer le statut délété ou non

del(16)(p13.3) Rubinstein Taybi LSI Rubinstein-Taybi (16p11.3) del(17)(p13.3) Miller-Dieker LSI Miller Dieker (17p13.3) del(17)(p11.2) Smith Magenis LSI Smith Magenis (17p11.2)

DiGeorge (22q11.2): TUPLE et TBX1 del(22)(q11.2) et dup DiGeorge LSI DiGeorge (22q11.2): TUPLE et TBX1 DiGeorge (10p13): DGSII délétion TUPLE1 Absence de délétion TUPLE1 del(22)(qter) Shank3 - autisme LSI Shank3 (22qter)

Technique FISH pan-subtélomérique Pan-subtel

? APPLICATIONS CLINIQUES (5/8) Rechercher une mosaïque : comptage sur noyaux interphasiques Ex: syndrome de Turner: XX/X/XY ? ?

Sonde locus spécifique APPLICATIONS CLINIQUES (6/8) CYTOGENETIQUE CONSTITUTIONNELLE PRENATALE Détection rapide (24h) des principales aneuploïdies ( et confirmation par caryotype) = statut des chromosomes 13, 18, 21, X et Y à partir de FR: taux de risque élevé (seuil 1/250) des marqueurs sériques maternels âge maternel >38ans signes d’appel échographiques (SAE) Sonde locus spécifique du chromosome 21  Dépister une anomalie chromosomique sur certains signes d’appel échographiques Ex: SAE cardiaques: délétion 22q11? RCIU sévère: délétion 4p16.3? Diagnostic pré-implantatoire : ex : diagnostic de sexe (affections liées à l’X)

APPLICATIONS CLINIQUES (7/8) CYTOGENETIQUE HEMATO-ONCOLOGIQUE Recherche d’anomalie ACQUISE Index mitotique des cellules anormales faible Qualité des métaphases médiocre Contamination des cellules tumorales par du tissu sain Intérêt DIAGNOSTIQUE, PRONOSTIQUE, et de suivi de la Maladie Résiduelle Mise en évidence de GENES DE FUSION ou de REARRANGEMENTS GENIQUES à l’origine de la prolifération maligne ou de DESEQUILIBRES GENIQUES (amplification ou délétion ) Intérêt de la FISH

Les différentes sondes utilisées en hémato-oncologie : LSI probe (Locus Specific Probe) 1- SINGLE COLOR Probe : Sonde spécifique d’un locus donné, marqué avec 1 seul fluorochrome Récemment : Cocktail de Single Color Probe ( LLC) 2- DUAL COLOR, SINGLE FUSION Probe : Cocktail de 2 sondes - une sonde spécifique d’un locus : FITC - une sonde spécifique d’un autre locus : SO 3- DUAL COLOR, DUAL FUSION Probe : 4- DUAL COLOR, ES Probe ( Extra Signal ) : 5- DUAL COLOR, BREAK APART Probe : 1 seule sonde spécifique d’un locus mais marquée avec 2 fluorochromes Nx normal :2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune) Nx normal :2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 2xfusions FITC-SO (jaune) Nx normal :2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune) – 1 ES(ExtraSignal) Nx normal : 2x fusions FITC-SO (jaune) Réarrangement du gène : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune)

Intérêt : - DELETION ? - AMPLIFICATION? 1- SINGLE COLOR Probe : Sonde spécifique d’un locus donné, marqué avec 1 seul fluorochrome Possibilité d’utiliser un cocktail de sondes Intérêt : - DELETION ? - AMPLIFICATION? - À coupler avec un locus témoin du chromosome impliqué

p53 ATM 1- SINGLE COLOR Probe : Sonde spécifique d’un locus donné, marqué avec 1 seul fluorochrome Cocktail LLC : p53 – ATM D13S319- 13q témoin – CEP12 Cocktail Oligodendrogliome: 1p36 – 1q25 19p13 – 19q13 CEP12 p53 D13S319 13q témoin ATM

 Traitement à l’Herceptine® N-MYC couplée à une sonde centromérique chromosome 2 dans les neuroblastomes  pronostic péjoratif HER2 couplée à une sonde centromérique du chromosome 17 dans les tumeurs du sein invasives CEP17 HER2  Traitement à l’Herceptine®

Intérêt : - TRANSLOCATION ? 2- DUAL COLOR, SINGLE FUSION Probe : Cocktail de 2 sondes - une sonde spécifique d’un locus : FITC une sonde spécifique d’un autre locus : SO Nx normal : 2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune) Intérêt : - TRANSLOCATION ?

2- DUAL COLOR, SINGLE FUSION Probe : Cocktail de 2 sondes - une sonde spécifique d’un locus : FITC une sonde spécifique d’un autre locus : SO Nx normal : 2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune)

INCONVENIENT: superposition de 2 signaux fluorescents ? = faux positif Problème pour la maladie résiduelle

Intérêt : - TRANSLOCATION ? 3- DUAL COLOR, DUAL FUSION Probe : Cocktail de 2 sondes - une sonde spécifique d’un locus : FITC - une sonde spécifique d’un autre locus : SO Nx normal: :2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 2xfusions FITC-SO (jaune) Intérêt : - TRANSLOCATION ?

t(8;21)(q22,q22) ETO/AML1 t(11;14)(q13;q32) IgH/CCND1 3- DUAL COLOR, DUAL FUSION Probe : Cocktail de 2 sondes - une sonde spécifique d’un locus : FITC - une sonde spécifique d’un autre locus : SO Nx normal: :2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 2xfusions FITC-SO (jaune) t(8;21)(q22,q22) ETO/AML1 t(11;14)(q13;q32) IgH/CCND1 t(14;18)(q32;q21) IgH/BCL2

Différencier différents points de cassure ? 4- DUAL COLOR, ES Probe ( Extra Signal ) : Cocktail de 2 sondes - une sonde spécifique d’un locus : FITC - une sonde spécifique d’un autre locus : SO Nx normal :2xFITC – 2xSO Translocation : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune) – 1 ES(ExtraSignal) Intérêts : TRANSLOCATION ? Sonde + spécifique Différencier différents points de cassure ?

1 extra signal (SO) TEL normal AML1 normal 1 gène de fusion (TEL/AML1)

1 extra signal (SO) BCR normal ABL normal 1 gène de fusion (M-BCR)

REARRANGEMENT d’un GENE ? 5- DUAL COLOR, BREAK APART Probe : 1 seule sonde spécifique d’un locus mais marquée avec 2 fluorochromes Nx normal : 2x fusions FITC-SO (jaune) Réarrangement du gène : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune) Intérêts : REARRANGEMENT d’un GENE ? Avantage : très utile s’il existe plusieurs partenaires pour un même gène Pour MLL :  50 partenaires différents Pour C-MYC : 3 partenaires différents Pour ALK : >5 partenaires différents - Inconvénient : ne permet pas déterminer le partenaire génique si pas de support métaphasique

MLL en 11q23 en 11q23 MLL C-MYC en 8q24 en 2p23 ALK 5- DUAL COLOR, BREAK APART Probe : 1 seule sonde spécifique d’un locus mais marquée avec 2 fluorochromes Nx normal : 2x fusions FITC-SO (jaune) Réarrangement du gène : 1xFITC – 1xSO – 1xfusion FITC-SO (jaune) en 11q23 MLL Réarrangement du gène « split » du signal C-MYC en 8q24 en 2p23 ALK

APPLICATIONS CLINIQUES (8/8) CONCLUSION - Quel examen cytogénétique prescrire à bon escient ? Clinicien Biologiste Place de la FISH / autres techniques (IHC, CISH, SISH, CGH…) Rapport coût/efficacité ?  FISH en pathologie constitutionnelle/acquise (JO 05/07): B5OO/une sonde (135€)- 2 sondes au maximum remboursées si support métaphasique  - Domaine de la recherche clinique et du diagnostic en routine ?

APPLICATIONS CLINIQUES (8/8) CONCLUSION ?

APPLICATIONS CLINIQUES (8/8) CONCLUSION Nombre de publications utilisant la technique CGH array pour exploration d’un retard mental ...