Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V.1 – Propriétés des lipides V.2 – Fluidité membranaire V.3 – Formation des rafts V.4 – Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique

Déplacements latéraux des lipides et des protéines => distances relativement longues => 2 dimensions (plan de la membrane) Coefficient de diffusion latérale mesuré : D L => 2 dimensions D L = <ℓ2><ℓ2> 4 t : parcours libre moyen (m 2 ) t : temps (s) => unité : m 2 /s

Pour un lipide : D L lipide ≈ m 2 /s D L lipide ≈ 1 µm 2 /s => ℓ ≈ √(4 t D L ) => ℓ ≈ 2 µm en 1 seconde (taille d'une bactérie) => tour d'une cellule sanguine en 12 s D L des lipides et protéines est relié à la fluidité de la membrane => Approximation : membrane = continuum => Equation de Einstein-Stockes D L = kT 4 π η a k : Constante de Boltzmann η : viscosité (1/fluidité) T : T°K a : rayon d'une particule sphérique

Pour une protéine : protéine assimilée à un cylindre de section a avec a proportionnel à => une partie de la protéine dans la membrane une partie de la protéine dans le milieu aqueux D L prot = kT 4 π η m h x [ ln ηmhηmh ηwaηwa -  ] h : hauteur de la membrane η m : viscosité membrane η w : viscosité milieu aqueux  : constante d'Euler => Pour une protéine de 100 kDa ≈ cylindre de section 5 nm la membrane : h = 10 nm et η m = N.s / m 2 le milieu aqueux : η w = N.s / m 2 => D L prot = m 2 /s ≈ D L lipide D L prot peu dépendant de la masse molaire

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.2 – 1. Théorie

Processus de luminescence : Emission de lumière après excitation : ➔ Chimique ➔ Mécanique (Friction) ➔ Physique Absorption de la lumière Photoluminescence : ✔ Fluorescence ✔ Phosphorescence

Fluorescence et Phosphorescence => Excitation d'électrons puis retour à l'équilibre  λ1  λ2 => Durée de vie Fluorescence ≠ Phosphorescence => Différent de par le système excité => Phosphorescence : durée de vie plus longue Diagramme d'énergie de Jablonski

Photoblanchiment : Après plusieurs cycles excitation - émission un fluorochrome ne fluoresce plus => il est « photoblanchi » (photobleached)

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes V.1 – Propriétés des lipides V.2 – Fluidité membranaire V.3 – Formation des rafts V.4 – Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.2 – 1. Théorie VI.2 – 2. Fluorochromes - fluorophores

Molécules fluorescentes = Fluorochromes => Petites molécules seules en solution = sonde fluorescente, ou colorant Fluorochromes liés à une macromolécule = Fluorophores => Fluorophores intrinsèques : naturels Acides aminés aromatiques (Trp), GFP, porphyrine => Fluorophores extrinsèques : synthétiques

La bioluminescence : La GFP (protéine fluorescente verte)

Protéines solubles de la famille de la GFP : tonneau 

Ser 65 Tyr 66 Ser 65 Tyr 66 Gly 67 fluorochrome de la GFP

Différentes protéines fluorescentes provenant de divers organismes Discosoma

Différentes protéines fluorescentes modifiées par biotechnologie

Applications : protéines membranaires fusionnées GFP lipides fusionnés GFP => localisation par microscopie confocale ou colocalisation

Présence de Tyr (jaune) Trp (bleu) et Phe (rouge) dans les protéines membranaire => Fluorescence modifiée par l'environnement hydrophobe + quenching => renseignements sur la structure et l'insertion dans la bicouche

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes V.1 – Propriétés des lipides V.2 – Fluidité membranaire V.3 – Formation des rafts V.4 – Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.2 – 1. Théorie VI.2 – 2. Fluorochromes-fluorophores VI.2 – 3. Expériences de FRAP

FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment Marquage par un fluorochrome

FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment Microscopie de fluorescence

FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment Rayon laser

FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment

FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment => Coefficient de diffusion

 D = ω 2  / 4 D L ω : rayon du laser  facteur de correction

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes V.1 – Propriétés des lipides V.2 – Fluidité membranaire V.3 – Formation des rafts V.4 – Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.2 – 1. Théorie VI.2 – 2. Fluorochromes-fluorophores VI.2 – 3. Expériences de FRAP VI.2 – 4. Expériences de FLIP

FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment => Coefficient de diffusion => Microdomaines

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes V.1 – Propriétés des lipides V.2 – Fluidité membranaire V.3 – Formation des rafts V.4 – Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.2 – 1. Théorie VI.2 – 2. Fluorochromes-fluorophores VI.2 – 3. Expériences de FRAP VI.2 – 4. Expériences de FLIP VI.2 – 5. Expériences de FRET

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

=> Utilisation de protéines de fusion GFP ou autres => FRET sur Trp (Quenching par Cys ou Met)

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.3 – Diffusion latérale des lipides

Diffusion latérale des lipides => études par la méthode de FRAP Exemple : Etude de l'influence du cholestérol sur la diffusion du DMPC dans des liposomes géants = GUV (Giant unilamellar vesicles) GUV DMPC GUV DMPC + Cholestérol => Sonde NBD - PE

Limites à la diffusion des lipides : Microdomaines (rafts) Présence de protéines (=> contournement)

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.3 – Diffusion latérale des lipides VI.4 – Diffusion latérale des protéines VI.4 – 1. Première expérience 1970

Ac marqués vert (fluorescéine) et rouge (rhodamine) => Suivi de la redistribution des protéines au cours du temps

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.3 – Diffusion latérale des lipides VI.4 – Diffusion latérale des protéines VI.4 – 1. Première expérience 1970 VI.4 – 2. Single particle tracking (SPT)

Couplage protéine – bille d’or colloïdal ou autre particule fluorescente via des anticorps spécifiques

Microscopie confocale

Suivi de la trajectoire avec une caméra CCD

=> MSD Mean Square displacement = fonction de déplacement quadratique moyen

Suivi d’un récepteur membranaire Couplé à un fluorophore

± Cholestérol

+ inhibiteur de l’actine

FRAP à l’échelle de la particule unique

FRAP sur la population entière

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.3 – Diffusion latérale des lipides VI.4 – Diffusion latérale des protéines VI.4 – 1. Première expérience 1970 VI.4 – 2. Single particle tracking (SPT) VI.4 – 3. FRET

Récepteurs du « non-soi » Toll-like => récepteur du LPS lipopolysaccharide bactérien

FRET : donneur = TOLL-LIKE Accepteur = ganglioside

=> Ganglioside excité (dans les rafts) => Proximité des 2 molécules => Le recepteur est confiné dans les rafts au moment de son activation

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.3 – Diffusion latérale des lipides VI.4 – Diffusion latérale des protéines VI.4 – 1. Première expérience 1970 VI.4 – 2. Single particle tracking (SPT) VI.4 – 3. FRET VI.5 – Limitation à la diffusion latérale des protéines

Formation d’agrégats, de rafts Intéraction avec le glycocalix Ou avec le cytoskelette À cause des jonctions cell.

Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 – Diffusion latérale théorique VI.2 – Spectroscopie de fluorescence VI.3 – Diffusion latérale des lipides VI.4 – Diffusion latérale des protéines VI.5 – Limitation à la diffusion latérales des protéines VII. Diffusion transversale des lipides

=> Enzyme qui permet le maintien des différences de composition entre feuillet membranaire interne et feuillet externe

Flippase = translocase

PC SM PE PS