Les risques microbiologiques

Les risques biologiques pour le personnel et l’environnement Jamais totalement éliminables; Difficiles à évaluer; On sépare : –Risques objectifs connus et probables –Risques potentiels : > connus ou inconnus > probabilité faible voire très faible

Moins le personnel est formé, plus il est exposé.

Les dangers Les dangers à éviter : - Banalisation - Relâchement de l’attention -Sous estimation des risques potentiels La maîtrise de ces dangers : - Défiance systématique vis à vis d’éléments apparemment inoffensifs - Expliquer sans dramatiser - Appliquer les mesures de sécurité - Former le personnel (risque gestuelle) - Locaux et matériel disponibles et adaptés - Suivi médical actif.

Les cas de contamination sont dus à : Faute de manipulation; Défaut de protection.

Voies de contamination : 1 – Voies aérienne : inhalation d’aérosol provoquée par : -pipetage - centrifugation - broyage – sonication - agitation - flambage d’anse L’aérosol se propage à distance du point d’émission et peut contaminer plusieurs personnes.

Voies de contamination : 2. Voie digestive : si la disparition du pipetage oral a réduit les risques, ceux-ci n’ont pas totalement disparu : - cigarette - alimentation - onychophagie - défaut d’hygiène (absence de gant, port de blouse souillée à la cafétéria …).

Voies de contamination : 3.Voie cutanée : - piqûre d’aiguille - coupure, égratignure - morsures, griffures (animaux, arthropodes) - éclaboussures - souillure des mains, du téléphone, robinets, serviettes … 4.Voie conjonctivale : - projection dans l’œil - aérosol - contamination par les oculaires des microscopes ou autres appareils optiques

Classification des microorganismes en fonction du risque Proposée par la Fédération européenne de biotechnologie et reprise par la norme AFNOR X 42040

CLASSE 1 Contient les micro-organismes qui n’ont jamais été décrits comme agent causal de maladie chez l’homme, et qui ne constituent pas une menace pour l’environnement. Correspond à la classe GILSP de l’OCDE (Good Industrial Large Scale Practice).

CLASSE 2 Regroupe les micro-organismes qui peuvent provoquer des maladies chez l’homme, et qui peuvent donc constituer un danger pour le personnel de laboratoire. La dissémination dans l’environnement est peu probable. Des moyens prophylactiques et/ou des traitements efficaces existent généralement.

CLASSE 3 Contient les microorganismes qui représentent une importance pour la santé du personnel de laboratoire, mais un risque mineur pour la population en général. Des moyens prophylactiques et/ou des traitements efficaces existent généralement.

CLASSE 4 Regroupe les agents qui causent des maladies graves chez l’homme et représentent un danger sérieux pour le personnel et la collectivité. On ne dispose pas habituellement de moyens prophylactiques et aucun traitement efficace n’est connu.

CLASSE E (risque pour l’environnement) la menace est plus importante pour l’environnement que pour l’homme (des listes existent dans des domaines tels que les produits phyto-sanitaires).

A ces niveaux de risque correspondent des mesures de prévention individuelles et collectives : Germes de classe 1 : niveau de sécurité biologique 1 Germes de classe 2 : niveau de sécurité biologique 2 Germes de classe 3 : niveau de sécurité biologique 3 Germes de classe 4 : niveau de sécurité biologique 4

Catégories de Microorganismes : Les microorganismes se répartissent en 4 catégories en fonction de leur pouvoir pathogène pour l'homme : *Catégorie 1 : non pathogènes, ne nécessitant aucune protection particulière *Catégorie 2 : pathogènes à faible risque *Catégorie 3 : pathogènes à haut risque *Catégorie 4 : virus pathogènes à très haut risque

A chaque catégorie de microorganisme correspond un niveau de sécurité biologique (NSB) requis, soit NSB 2 (laboratoire de base, microorganismes de catégories 1 et 2), 3 (laboratoire de confinement, microorganismes de catégorie 3), et 4 (laboratoire de confinement à haute sécurité, microorganismes de catégorie 4). Le NSB1 correspond au "laboratoire standard" où ne sont pas manipulés de microorganismes.

ESTIMATION DES RISQUES BIOLOGIQUES Classification (guide AFNOR )Légende : opp : opportuniste : genre ou espèce saprophyte pouvant se développer sur des sujets immunodéprimés : vo : la vaccination est obligatoire pour les manipulateurs (sauf s’ils sont immuns) : vr : la vaccination est recommandée : L : le port de lunettes de protection est recommandé : G : le port de gants est obligatoire.

Biosécurité – niveau 1 Agents non dangereux pour l’environnement et le personnel Laboratoire non séparé Pas d’équipement de confinement Manipulation selon les règles générales de microbiologie Constitue l’équipement de base de tous laboratoires.

Pratiques de base : Limitation d’accès, placée sous la responsabilité de la direction du laboratoire, Décontamination des surfaces une fois par jour et après chaque contamination directe par du matériel vivant, Décontamination de tous matériel et produit contaminés avant évacuation, Pipetage à la bouche interdit, Alimentation, boisson, tabac, usage de cosmétiques interdits, Lavage des mains avant de sortir du laboratoire, Mise en place de mesures destinées à limiter la création d’aérosols, Port de vêtements de travail, Eviter les éponges.

Mesures particulières : - Les produits et matériels contaminés, non décontaminés sur place sont transférés dans des containers étanches. - Programme de lutte contre les insectes et les rongeurs. Equipements : - Pas d’équipements particulier requis Locaux - Facilement nettoyables - Paillasse imperméable et résistante aux acides, bases, solvants organiques. - Mobiliers solide, espace entre mobilier et équipement permettant le nettoyage aisé - Présence d’un lavabo (lavage des mains) - Fenêtres fermées ou équipées de moustiquaires

Biosécurité niveau 2 Agents modérément pathogènes; Recommandations – niveau 1 plus : - Accès limité lors des manipulations, - Formation aux manipulations de pathogènes pour le personnel, - Opérations générant des aérosols effectuées dans des hottes biologiques.

Mesures particulières : -Accès peut-être interdit à certains personnels (fragilité vis à vis du risque des personnes non vaccinées) - Affichage du risque ( bio Hazard) - Liste nominative et numéro de téléphone des responsables -Procédures d’entrée - Tenue de travail enlevée pour sortir du laboratoire (ou recouverte) - Port de gants -Limiter l’usage des seringues : Seringues jetables Limiter la production d’aérosols Evacuation dans des containers spéciaux Ne jamais ôter l’aiguille ou tenter de replacer le capuchon après usage - Accidents ou incidents conduisant à une surexposition : Alerter Appliquer une surveillance Enregistrer - Eventuellement effectuer un suivi sérologique du personnel - Rédiger un manuel de biosécurité adapté aux activités du laboratoire et former le personnel

Equipements : Postes de sécurité microbiologiques de type I ou II pour les opérations générant des aérosols (centrifugation, broyage, mélange, agitation … inoculation ou récolte de matériel infecté) impliquant la manipulation des volumes importants ou concentrés en agents pathogènes Locaux : - Autoclave pour la décontamination

PSM

Poste de sécurité microbiologique (PSM) -Les enceintes à flux laminaire horizontal, les enceintes à flux laminaire vertical à recyclage partiel et les enceintes à flux laminaire vertical à recyclage total ne sont pas des PSM et ne protègent que la manipulation. -Seuls les PSM répondant à la norme NF X , type I ou II, doivent se trouver dans un environnement de NSB2 ou 3.

Poste de sécurité microbiologique (PSM) Enceinte destinée à assurer une protection du manipulateur et de l'environnement et le cas échéant du produit manipulé, vis-à-vis de substances biologiquement dangereuses. *Type I : chambre ouverte, en dépression, à extraction filtrée et totale *Type II : chambre ouverte, en dépression, à évacuation filtrée, à recyclage partiel, doublée d'un flux laminaire vertical *Type III : boîte à gants, en dépression, à extraction filtrée et totale).

Poste de sécurité microbiologique (PSM) Les PSM I et III ne protègent que le manipulateur et l'environnement. Les PSM II protègent le manipulateur, l'environnement et la manipulation. Les PSM II sont équipés de 1 ou 2 moteurs, selon le type.

La classification des PSM PSM de type I : -protection du manipulateur par la création d’un flux d’air laminaire entrant dans l’enceinte -Protection de l’environnement par filtration de l’air -Le produit n’est pas protégé car il est en contact avec l’air du laboratoire

La classification des PSM PSM de type II - Protection du manipulateur par une aspiration crée au bord du plan de travail - Protection de l’environnement par filtration de l’air - Protection du produit par un flux d’air descendant préalablement filtré

La classification des PSM PSM de type III -protection de l’opérateur qui est totalement en dehors de l’enceinte (isolateur) -Protection de l’environnement par filtration de l’air -Pas de contact avec l’air du laboratoire

Maîtrise de l’environnement du PSM Filtration de l’air -filtre HEPA (High efficacity particulate air) Stérilisation et décontamination Changement de tenue

Connaître son PSM Schéma aéraulique Surveiller ses delta P Regarder les alarmes Vitesses : 0,45m/s

Les exigences techniques Étanchéité de l’enveloppe extérieure Test DOP Débit d’air : 0,45m/s +/- 20% Bruit Éclairage Sécurité électrique Température (T<+8°C après 4h) Pas d’émission d’air en dehors du PSM

Conseils d'utilisation des PSM (1) - Mettre l'appareil en marche au moins 15 minutes avant de commencer à travailler. Ne l'arrêter qu'en dehors des périodes de travail ; - Ne pas introduire dans le PSM d'objets susceptibles de provoquer des turbulences (PSM II) ; - Eviter d'encombrer le volume de travail de façon trop importante afin de ne pas obturer les plans ou grilles de reprise d'air et de perturber le moins possible le flux d'air (PSM II); - Ne pas introduire dans le PSM de matériels réputés polluants tels que bois, liège, carton, papier, crayon, gomme (PSM II) ;

Conseils d'utilisation des PSM (2) - Ne pas introduire dans le PSM de sources de chaleur importante. L'emploi des becs bunsen est vivement déconseillé, utiliser plutôt les appareils piézoélectriques si l'emploi d'une flamme est absolument indispensable (PSM II) ; - Ne jamais introduire la tête dans le PSM ; - Ne pas projeter de liquide ou de solide sur la face du filtre. N'accrocher ni ne suspendre aucun objet sur les grilles de soufflage ; - Nettoyer et dépoussiérer tout objet introduit dans le PSM ;

Conseils d'utilisation des PSM(3) - Utiliser des équipements vestimentaires adaptés et propres ; Les gants doivent recouvrir les manches. La blouse doit être fermée jusqu'au col ou se fermer dans le dos. -Ne pas éternuer ni tousser en direction de la zone stérile (PSM II) ; -Ne pas effectuer de mouvements rapides ou de gestes brusques dans le volume de travail (PSM II) ;

Conseils d'utilisation des PSM (4) - Maintenir la zone de travail propre. La nettoyer avant et après chaque utilisation et la désinfecter avec un chiffon non pelucheux imbibé d'un décontaminant adapté ; - N'allumer les lampes UV qu'un quart d'heure avant d'utiliser le PSM et en fin d'utilisation. L'utilisation prolongée des UV ne permet pas une meilleure stérilisation et entraîne la détérioration du matériau de la structure et l'usure des tubes UV. Contrôler et changer régulièrement ces tubes.

Contrôles des PSM Les contrôles doivent avoir lieu : - lors de la réception du PSM ; - lors du changement du (des) filtre(s) HEPA ; - lors du déplacement du PSM ; - après projection de liquide sur le filtre HEPA ; - systématiquement, au moins une fois par an ;

Contrôles des PSM (2) Les contrôles doivent porter essentiellement sur (Norme NF X ) : - la propreté particulaire et biologique de l'air soufflé sur le plan de travail (PSM II) et de l'air extrait du poste ; - la vitesse et, éventuellement, la laminarité du flux d'air ; - l'étanchéité du PSM et l'efficacité du bandeau de reprise ;

La qualification du PSM Le schéma aéraulique : permet de visualiser les écoulements Mesure de la vitesse d’air frontale : vitesse moyenne de l’écoulement de l’air dans le plan de l’ouverture du PSM Test d’étanchéité du filtre (test DOP) Vitesse du flux

Limiter les sources de contaminations Habillage Comportement Hygiène Choix des matériaux et du matériel Nettoyage et décontamination

Nettoyer une hotte à flux laminaire Essuyage humide avec un détergent désinfectant (ammonium quaternaire, aldéhydes…) Éviter les dérivés chlorés (oxydants Ne pas de servir d’alcool pour le bionettoyage (bactéricide, faiblement fongicide, non sporicide)

Nettoyer une hotte à flux laminaire Alterner les détergents désinfectants Faire des prélèvements de surfaces Enlever tout le superflu Attendre 15 à 20minutes avant de manipuler en cas d’arrêt de la soufflerie

Le travail sous flux laminaire Limiter le nombre de personnes Pas de déplacement rapides Ne pas passer à proximité du produit sous flux Toujours travailler de coté et jamais au dessus du produit Préparer tout le matériel nécessaire à portée de main afin d’éviter les déplacements trop nombreux

Le travail sou flux laminaire Considérer tout objet à terre comme contaminé Décontaminer régulièrement ses gants à l’alcool Changer régulièrement sa pipette d’alcool Ne pas toucher son masque ou sa charlotte Sortir dans le sas pour se moucher et changer les gants

Le travail sous flux laminaire Ne pas s’asseoir, ni se reposer sous un flux laminaire Ne pas rentrer sa tête sous flux Réduire les conversations au strict minimum Respecter les consignes d’habillage Faire en sorte que les manches jouxtent toujours les gants (pas de peau apparente) Se laver les mains avant d’enfiler ses gants stériles

Le travail sous flux laminaire Proscrire les mouvements rapides Éviter de sortir les mains : chaque sortie des avants bras entraîne des turbulences

Le travail sous flux laminaire A la fin du travail, laisser le PSM sous ventilation de travail afin de purger l’intérieur de la zone de travail Ne pas encombrer le volume de travail inutilement Limiter les sources de chaleur (mouvements d’air convectifs) et proscrire le bec bunsen

Le travail sous flux laminaire Ne jamais protéger d’eau sur les surfaces des filtres Suivre la perte de charge des filtres S’assurer que la qualification périodique est effectuée Faire fonctionner le PSM 15minutes avant de manipuler

Préparer sa manipulation S’habiller Se laver les mains Décontaminer sa hotte à l’alcool à 70° Introduire le matériel nécessaire sous la hotte pour réaliser la manipulation Décontaminer les produits Se relaver les mains ou les passer à l’alcool à 70°V/V Enfiler ses gants Commencer la manipulation

Que doit-on retrouver sous une hotte ? La série de produit à analyser Les milieux usuels d’ensemencement Les consommables (bols de filtration…) Le marqueur si les éléments n’ont pas été marqués auparavant Une réserve de gants Une pissette d’alcool

Et bien entendu !!! Ne surtout pas oublier les règles essentielles de la pharmacie : enregistrer les manipulations selon les principes BPF !! Et respecter les procédures …

Travailler autour du bec bunsen Respecter le halo de stérilité (15cm autour du bec) Faire des gestes calmes Ne pas laisser de flacons ouverts Ne pas poser les bouchons à l’endroit mais à l’envers Organiser son poste de travail