Filière : Techniques de santé. Option : Technicien de laboratoire.. Module :histologie/cytopathologie. Réalisé par : Encadré par : Loubna El Faunane Pr. El Fatemi Hind Siham Essakhi Soumia El Mrabet Année universitaire : 2016/2017

 Introduction o Types de prélèvements histologiques o Les étapes de la technique standard 1.Fixation; 2.Enregistrement et réception des échantillons 3.Examen macroscopique; 4.Inclusion en paraffine; 5.Coupe du bloc inclus en paraffine au microtome; 6.Coloration HES (Hématoxyline-éosine-safrin); 7.Examen au microscope;( lecture des lames); 8.Rédaction du compte rendu; 9.Stockage des lames et des blocs de paraffine et archivages du double du compte rendu;,  Conclusion  Référence 2

Le diagnostic histo-pathologique est fondé d’une part, sur l'analyse des modifications tissulaires par différentes techniques anatomopathologiques dont la technique standard la plus utilisée en routine, et d’autre part, la synthèse des données histo- pathologiques et cliniques exprimées par l’intermédiaire d’un compte-rendu.  Quelles sont les différentes étapes de cette technique? 3

Types de prélèvements tissulaires: Biopsie : La biopsie consiste à prélever un fragment de tissu sur un être vivant:  Par ponction à l'aide d'une aiguille coupante ou d'un trocart (foie, rein, os...);  Par biopsie chirurgicale;  Au cours d'une endoscopie; 4

Pièces opératoires :  matériel de résection à la curette (endomètre, vessie, prostate) ou de pièce d’exérèse segmentaire ou totale, d’une tumeur ou d’un organe. Pièce d’oesogastrectomie pour cancer du bas oesophage Rate de 30 cm selon le grand axe 5

Autopsie: L’autopsie (ou nécropsie) correspond à un examen anatomopathologique pratiqué sur un cadavre. Les autopsies médico-légales sont pratiquées sur ordre de la justice (réquisition du procureur, ou ordonnance d’un juge d’instruction) dans tous les cas de mort suspecte, notamment lorsqu’il n’y a pas eu de délivrance de permis d’inhumer. 6

Préfixation:  Les organes creux doivent être ouverts et si nécessaire lavés de leur contenu. prévenir l'autolyse des muqueuses ;  Les organes pleins volumineux doivent être coupés en tranches faciliter la pénétration rapide et homogène du fixateur;  Les poumons peuvent être fixés par insufflation d’une solution de formol dans les bronches ou coupés en tranches. 7

Fixation(1) Un moyen technique(physique ou, surtout chimique)qui permet de garder les structures tissulaires à étudier dans un état aussi proche que possible de l’état vivant. Intérêts de la fixation :  I mmobilisation des constituants tissulaires/cellulaires ;  Prévient l’autolyse cellulaire ;  Prévient de la putréfaction bactérienne post-mortem ; 8

Fixation(2) Un bon fixateur doit :  Pénétrer vite dans les tissus;  Etre isotonique;  Provoquer un minimum d’altération physique et chimique au niveau de la cellule Nature de fixateur: Formol: le fixateur le plus habituellement utilisé est le formol à 10% tamponné;Pour les biopsies de petite taille Liquide de Bouin; Liquide de Carnoy; Alcool ; 9

Fixation(3) Paramètres techniques:  L’immersion du prélèvement dans le fixateur sera réalisée immédiatement et tout au plus dans un délai d’une heure.  Le volume du fixateur doit représenter environ 10fois le volume de la pièce.  Durée de fixation pour: des biopsies : minimum de 2h à 6h et maximum de 24h. des pièces opératoires: dépendra du volume de la pièce et généralement de 24 à 48 heures.  Fixateur: formol 10% tamponné à pH 7.2 idéalement 10

Si le laboratoire est situé à proximité immédiate du lieu de prélèvement, celui-ci peut être acheminé rapidement (moins d’une heure) et confié à l’anatomopathologiste qui choisira les conditions de fixation les plus adaptées. Sinon, la fixation doit être effectuée par le médecin préleveur. 11

L’enregistrement et la réception des échantillons: Lorsqu’un prélèvement parvient au laboratoire, il est enregistré et reçoit un numéro d’identification unique. Les prélèvements sont adressés avec : ● L’identification du patient sur le contenant ; ● et une feuille de demande doit contenir:  L’identité du patient  Le nom du médecin préleveur et ses coordonn és  La nature de prélèvement  Les renseignements cliniques pertinents  … 12

Étude macroscopique:  Une partie essentielle de l’étude d’une pièce opératoire Après fixation de 12 à 24H (parfois délai supplémentaire de décalcification) :  La pièce est examinée, mesurée, pesée puis disséquée. Mesure et dissection d’une pièce d’oesogastrectomie fixée dans le formol puis sélection des prélèvements destinés à l’étude 13

Pièce d’exérèse de prostate et de vésicules séminales A. Surface tatouée à l’encre de chine. B. Tranche de section de la prostate : l’encre ne pénètre pas en profondeur. En bas lors de l’examen microscopique, l’encre permet de repérer exactement les limites de la résection chirurgicale (limite noire à gauche). 14

 Donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment la taille et la localisation d’un cancer).  Il permet de sélectionner les territoires à prélever pour l’étude microscopique : zones lésées, zones d’aspect macroscopique sain et limites d’exérèse.  Après le choix des prélèvements destinés à l’analyse microscopique, les restes de la pièce opératoire sont conservés pendant quelques jours ou semaines afin de pouvoir en cas de nécessité effectuer des prélèvements complémentaires. 15

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Couper la pièce en tranches fines Encrer les limites d’exérèse Cancer Dissection du curage 17

 Cassettes : Elles comportent de petites perforations pour que les prélèvements baignent dans les produits Tumeur Mamelon Prélèvements systématiques au niveau des différents quadrants Zone de mastopathie Curage 18

Déshydratation: 19 Cette étape prépare les tissus à l'inclusion en paraffine. Elle est réalisée dans un automate. Étape nécessaire car la plupart des milieux d'inclusion sont hydrophobes. On réalise des bains d'alcool par paliers qui au fur et à mesure vont remplacer l'eau par l'alcool.

Déshydratation( technique)  On procède donc par étapes en remplaçant:  L’eau par un alcool (70°,95°,100°);  L’alcool par un solvant organique (Toluène);  Toluène par la paraffine; 20

Inclusion en paraffine:  Le prélèvement est imprégné de paraffine fondue afin de le rigidifier pour pouvoir le couper ensuite. Paraffine fondue  La paraffine est liquide à 56°.  A température ambiante, la paraffine se solidifie 21 Séjour dans l’étuve: 24h à 56°C

22 Inclusion en paraffine: (technique)  Maintenir la paraffine a l’état liquide par un séjour dans une étuve dont la température est réglée légèrement au dessus de son point de fusion;  Distribution de la paraffine;  Inclusion des pièces ;  Collage des cassettes sur les moules;  Le refroidissement du paraffine amène sa solidification en un bloc prêt à être coupé.

Autres types d’inclusions:  Inclusion en paraplast (mélange de paraffines purifiées et de polymères plastiques).  Méthode d’inclusion particulière, la celloïdine nécessite une infrastructure particulière car il s’agit d’un mélange explosif (solution dans un mélange d’éther et d’éthanol).  Double inclusion en celloïdine et en paraffine. 23

Coupe au microtome:  Utiliser des microtomes pour réaliser des coupes fines voire ultra-fines pour la microscopie électronique à partir de blic de tissus réalisés (paraffine ou résines) afin de pouvoir observer les détails cellulaires.  Le bloc de paraffine contenant le tissu est coupé en fins rubans de 4 à 5 µm. 24

ULTRAMICROTOME  Un ultramicrotome est un appareil de très grande précision qui permet des coupes de 60 à 100 nm servant en microscopie électronique. 25

Etalement sur lames: 26  Plusieurs motifs de coupe tissulaire sont étalés sur lames.  Les lames sont alors séchées afin d'assurer une bonne adhésion à la lame des tissus avant coloration.  Passage dans bains de toluène, d’alcool et d’eau (déparaffinage, réhydratation)

Coloration standard HES: Principe : (Hématoxyline-Eosine-Safran)  L'hématoxyline colore les noyaux en violet foncé,  L'éosine, les cytoplasmes en rose,  et le safran, les fibres collagènes en jaune. 27 Coloration hématoxyline-éosine-safran d’une muqueuse de trompe utérine;

Technique Marquage: (après déparaffinage) 1.Tremper les lames dans un bain d’Hematoxyline de Harris pendant 1 min. 2.Rincer a l’eau. 3.Changer l’eau jusqu’a ce que celle ci soit claire. 4.Tremper les lames dans un bain d’Eosine pendant 1-2 minutes. 5.Rincer à l’eau. 6.Changer l’eau jusqu’a ce que celle ci soit claire. 7.Tremper dans le safran alcoolique pendant 15 minutes. 8.Rincer avec 3 bains d’alcool absolu pendant 2 min. 9.Faire deux bain de Xylène. 10.Monter les lamelles. 28

Applications:  La coloration HES est la coloration trichromatique la plus couramment utilisé en histologie. La coloration des fibres de collagène par le safran facilite et accélère la lecture des lames.  Organes ou tissus concernés  La coloration hématoxyline éosine safran étant une coloration standard, tous types d’organes ou de tissus peuvent être colorés. 29

30 Remarque: Décoloration  En cas de mauvais résultat, ou sur demande du pathologiste, une coloration de routine peut être décolorée et recolorée. La décoloration s’effectue à l’alcool acide en 30 minutes.  Il est impossible de décolorer les colorations spéciales comprenant une imprégnation ou une réaction chimique.

 La coupe colorée est protégée par une lamelle de verre collée, ou par un film plastique transparent.Elle est alors prête à être analysée au microscope par un médecin anatomopathologiste. 31 Coupe du tissu étalé sur lame et coloré en HES

Examen microscopique:  Cette seule coloration permet le diagnostic de la grande majorité des lésions tumorales et non tumorales.  Dans environ 20% des cas, des analyses spécialisées (colorations spéciales, immunohistochimie, hybridation in situ, PCR) sont requises. 32

Rédaction du compte rendu  Un compte-rendu, histo--pathologique écrit est un document de communication entre clinicien et pathologiste dans lequel les lésions sont décrites, puis interprétées afin de formuler une conclusion. Cette dernière doit être claire et précise. Pour une tumeur:  La dénomination précise proposée par une classification internationale, par exemple de l'OMS;  Le caractère bénin ou malin;  L'histogénèse ;  La différenciation du cancer; 33

 D'autres informations seront signalées selon le type de prélèvement:  Biopsie exérèse: taille de la tumeur, sa distance par rapport aux différentes limites de résection.  Pièce opératoire: apporter les éléments aidant à l'évaluation du stade clinique: taille de la tumeur, extension locale, état des limites de résection, nombre de ganglions métastatiques. 34

 Le délai de réponse nécessaire, en raison des diverses contraintes techniques, est généralement de l’ordre de 48 heures au minimum.  Les consultations inter- pathologistes qui peuvent être demandées pour plusieurs raisons: Incertitude diagnostique ou discordance entre plusieurs pathologistes du même centre. 35

La lecture du compte rendu histologique  C'est le devoir du clinicien de connaître le type histologique exact de la tumeur avant d'entamer un traitement.  Si besoin, le pathologiste proposera de lui- même des examens complémentaires sur les lames histologiques ou en biologie moléculaire. 36

Stockage et archivage - Stockage des lames montées et des blocs de paraffine: * Afin de compléter les analyses, si nécessaire, ou de revoir le diagnostic, les coupes montées sur lames ainsi que les blocs de paraffine contenant les échantillons anatomiques doivent être conservés par le laboratoire d’anatomo-pathologie la durée de stockage est définie réglementairement (au moins 10 ans). * À température ambiante,ces objets ne libèrent pas de substances chimiques dangereuses. - Archivage du double du compte-rendu; 37

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 GUIDE D’ANATOMOPATHOLOGIE; Ordre professionnel des technologistes médicaux du Québec  texte/dg_ap_tech01.html  ( AnatomiepathologiqueFacultBroussais.html ) Dernière mise à jour02 février 2002, Date de consultation :28/02/2017  Dernière modification effectuée le 31 Janvier 2010,Date de consultation: 28/02/2017     Plaquette_technique_standard_HISTOLOGIE.pdf df 40